1. 서 론

침편모조류(Raphidophyceae)에 속하는 대표적인 유해조류 중 하나인 Chattonella는 열대, 아열대 및 온대해역에 광역적 으로 출현하며, 대량 발생 시 해양생물 및 수산자원에 막대 한 경제적 손실을 입히는 대표적인 적조생물로 알려져 있다 (Imai and Yamaguchi, 2012). 특히, 일본 세또 내해에서 발생하 는 대표적인 어패류 폐사 원인종으로 알려져 있다(Imai et al., 2006).

우리나라 연안 및 내만 해역에서는 1983년 남해동부의 진 동만에서 Chattonella sp.에 의한 적조가 처음으로 보고되었으 며(Park et al., 1988), 최근 남해 연안 및 서해중부의 태안반도 주변해역에서 이들 종의 출현빈도 및 세포밀도가 증가하고 있다(NIFS red tide homepage, http://www.nifs.go.kr /redtideInfo).

Chattonella는 세포의 크기 및 모양, 엽록체의 세부형태 등 의 형태학적 분류키를 통해 총 Chattonella antiqua, C. marina, C. minima, C. ovata, C. subsalasa, C. globosa, C. verruculosa의 7 종이 알려져 있다(Hallegraeff and Hara, 1995;Demura et al. 2009). 하지만, Chang et al.(2012)는 LSU rDNA 염기서열 분 석을 통해 C. globosa가 무각 형태의 Dictyocha fibula var. stapedia(Dictyochophyceae, Heterokontophyta)로 밝혀졌음을 보고하였고, 18S rDNA 염기서열 분석 및 주사전자현미경 관찰을 통해 C. verruculosa가 Pseudochattonella 종으로 Dictyochophyceae에 속하는 새로운 종으로 보고하였다.

따라서, 단순한 크기의 비교 및 엽록체의 숫자 등의 형태 적 분류만으로는 종 동정이 어렵기 때문에(Imai, 2000;Katano et al., 2009) Nuclear ribosomal DNA(rDNA), Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein(psaA), Ribulose bisphosphate carboxylase gene(rbcL) 등의 다양한 생물학적 마커를 이용한 염기서열분 석 방법 또한 종 동정에 이용되고 있다(Orsini et al., 2002;Beszteri, 2005;Hosoi-Tanabe et al., 2006).

국내에서는 아직까지 Chattonella 적조에 의한 수산피해는 없고, 해마다 발생하는 종은 아니기 때문에 이들 Chattonella 에 대한 발생기록 혹은 영양염 등의 환경적 성장요인에 대 한 연구(Noh et al., 2009;2010) 외에는 기본적인 정보가 부족 한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 득량만 Chattonella 적조 발생 해역에서 채수한 시료에서 분리한 Chattonella 시료를 대상으로 single-cell PCR 기법을 이용하여 28S rDNA, rbcL, psaA의 염기서열분석을 통한 종 분석을 수행하였다.

2. 재료 및 방법

2.1 시료채집 및 단세포 분리

본 연구에 사용한 시료는 2017년 7월 전라남도 고흥군 득 량만 중부 해역의 득량도 상부해역 (34°61′67″N, 127°10′70″E)에서 발생한 Chattonella 적조(70 ~ 350 cells mL^-1)시료로 Niskin 채수기를 사용하여 표층해수 시료 2 L를 채수하였다. 채수 즉시 1 L 채수병 두 개에 나누어 담아 ice box에 보관하 여 실험실로 운반하였다. 이 후 도립현미경 하에서 생시료 를 관찰하면서 유영력이 있는 Chattonella 세포들을 모세관 피펫을 이용하여 분리하고 멸균해수를 이용하여 2 ~ 3회 반복 세척한 후 한 세포씩 분리하여 PCR 튜브에 옮겨 담아 사용 하였다.

2.2 Single-cell PCR

Chattonella의 종 동정을 위해 유용한 유전체 영역들인 28S rDNA, 엽록체 핵에 존재하는 Rubisco 유전자, Ribulose bisphosphate carboxylase gene(rbcL)와 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein(psaA)의 세 영역의 핵산염기서열 정보 를 분석하였다. 득량만에서 분리한 세포 중 17세포는 28S rDNA, 5세포는 rbcL, 6세포는 psaA를 증폭하는데 사용하였 다. 본 실험에 사용된 Primer 정보는 Table 1과 같다. PCR 증 폭은 EmeraldAmp® GT PCR Master Mix(Takara, Japan)를 이용 한 PCR 완충액에 5 pmol oligonucleotide primer는 1μℓ, 여기에 모세관 피펫을 이용해 분리한 세포를 template DNA로 첨가 하고 증류수로 최종 반응 부피를 20μℓ 로 맞추었다. PCR 증 폭은 ProFlex PCR System(Life Technologies, USA)를 사용하 여 수행하였다. Hot-start PCR 과정으로 98℃ 에서 1분간 pre-denaturation을 수행하였고, 98℃ 에서 10초, 58℃ 에서 30초, 72℃ 에서 1분 30초의 조건으로 총 35회 반복하였다. 증폭된 PCR 산물은 0.7% agarose gel에서 전기영동한 후 AccuPrep PCR Purification Kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다. 유전자 서열 분석은 마크로젠에 의뢰하여 수행하였다.

2.3 DNA 염기서열 결정 및 계통수 작성

Chattonella 종의 28S rDNA, rbcL와 psaA의 세 영역의 염기 서열 비교를 위해 결정된 염기서열과 GenBank database에 등 록된 동일 분류군의 염기서열을 Blast network service를 이용 하여 비교하였다. 또한 genetic distance는 Kimura 2-parameter 분석모델을 이용하여 계산하였으며, similarity score를 구하였 다. 계통분석은 PAUP*4.0b10을 이용하여 Kimura 2-parameter 의 근린결합분석(neighbor-joining; NJ)(Saitou and Nei, 1987)을 실시하였다. 계통수의 분지에 대한 지지도를 측정하기 위해 NJ의 bootstrap 값을 1,000회 반복하였다.

28S rDNA에서는 Heterosigma akashiwo(GenBank acquisition AB217644, AB217645), rbcL와 psaA에서는 H. akashiwo (GenBank acquisition EU168190, EU168191)와 Fibrocapsa japonica (GenBank acquisition AX067619, JX067625)는 outer group으로 사용하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1 세포 형태 관찰

2017년 7월 득량만 중부의 표층해수에서 총 28세포의 Chattonella를 분리하였다. 도립현미경 하에서 관찰한 Chattonella 세포들의 모습은 Fig. 1와 같은 형태로 관찰이 되 었다. 또한, 분리한 총 28 세포들 중 17 세포의 길이를 측정 한 결과(Table 2) 장축은 평균 74.0 ± 10.1μm 이고 단축은 평균 33.1 ± 3.6 μm 이었다. 기존에 보고된 Chattonella 세포 크기를 비교 하면 C. antiqua는 장축 74 ~ 90 , C. marina는 장축 30 ~ 70μm, C. ovata는 장축 55 ~ 65μm 을 보였다(Table 2). 본 연구에서는 장축 74.0 ± 10.1μm 으로 C. antiqua와 유사한 길이를 보였다. 하지만 배양조건 혹은 환경조건에 따라 Chattonella 세포 크 기 및 형태에 변형이 발생한다고 보고되었다(Oyama and Yoshimatu, 2007). 따라서 세포 크기 및 형태만으로는 종 식별 이 어려웠으며, 아래와 같이 분자계통 분석을 실시하였다.

3.2 Single-cell PCR을 이용한 분자계통 분석

득량만 시료에서 분리한 세포 중 17세포는 28S rDNA, 5세 포는 rbcL, 6세포는 psaA를 증폭하는데 사용하였다. 증폭된 산물을 0.7% agarose gel로 전기영동한 결과, 28S rDNA에서는 10개, rbcL는 5개, psaA는 5개의 시료에서 뚜렷한 약 1 ~ 1.5 kb 의 PCR 산물을 얻었다. 해당 시료를 대상으로 핵산염기서열 정보를 해독한 결과, 28S rDNA 영역에서는 848 bp, rbcL영역 에서는 1,256 bp, psaA영역에서는 1,201 bp의 결과물을 얻었으 며, 모두 Chattonella로 검색되었다. 이들 염기서열 정보는 Genbank에 Accession No. MK257155 ~ 58로 등록하였다.

최근 single-cell PCR 기법이 현장시료로부터 식물플랑크톤 종을 유전적으로 식별하는데 활용되고 있다. 예를 들면, Hamilton et al.(2015)는 single-cell PCR을 이용하여 현장시료에 있는 규조류의 rbcL, 18S, psbA 염기서열을 성공적으로 분석 하여 분자계통수를 보고하였다. 본 연구에서는 rbcL, 28S, psaA 염기서열을 single-cell PCR로 분석하였다. 염기서열 분 석결과는 Genbank에 등록되어 있는 Chattonella의 rbcL, 28S, psaA 유전정보를 이용하여 이들의 유전적 유사도를 비교한 결과, 28S rDNA의 유전형은 동일 분류군 간에 높은 유사도 를 보였으며, Chattonella antiqua, C. marina, C. marina var. antiqua, C. marina var. marina, C. marina var. ovata, C. ovata 등 의 국내·외 배양주간의 유전자형이 동일하였다(< 99.9% 염기 유 사도)(Fig. 2-A). rbcL영역에서는 Chattonella cf. ovata, C. marina, C. antiqua 등의 배양주와 높은 유사도를 보였다(< 99.9% 염 기유사도)(Fig. 2-B).

Hirashita et al.(2000)와 Hosoi-Tanabe et al.(2006)는 Chattonella 중 Chattonella marina, C. antiqua, C. ovata의 3개 종은 광학현 미경 상으로 관찰되는 형태적 특징을 통해 최초의 종 동정 이 이루어졌으나, LSU rDNA를 이용하여 염기서열 비교를 한 결과 세 종은 높은 서열 유사성이 관찰된다고 보고하였 다. 또한, Demura et al.(2009)는 Chattonella antiqua, C. marina, C. ovata 세 종의 형태적 동정과 더불어 ITS, rbcL, COI의 마 커를 이용하여 유전적 다양성을 비교한 결과 C. marina의 경 우 C. marina var. antiqua, C. marina var. ovata 등 C. marina의 다양한 유전적 형태로 존재함을 보고하였고, Yamaguchi et al.(2008)는 cyst에서 분리한 C. marina의 유전적 분석을 통해 C. marina의 한 가지로 C. marina var. marina를 보고하였다.

반면에, psaA영역에서는 각각의 염기서열 결과물이 2개의 유전자형으로 나뉘었으며, 그 2개의 유전자형들 사이에 총 5 개의 위치에서 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)이 존재하는 것으로 확인하였다(미발표 자료). 이는 계 통분석 결과에서도 하나의 그룹은 C. marina var. marina, 다 른 그룹은 C. marina var. ovata로 분리가 되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2-C). Klopper et al.(2013)는 침편모조류의 종 동정을 위해 psaA를 사용하여 분석을 한 결과, C. marina와 유사하고 염기서열 내에서의 유전적 다형성이 나타났다고 보고하였다. 이와 같이 Chattonella 종들 간의 유전적 형태적 특징이 매우 유사하여 최근에는 C. antiqua와 C. ovata를 C. marina의 아종으로 분류하고 이들을 “marina complex”로 제시 하고 있다(Demura et al., 2009).

4. 결 론

본 연구에서는 2017년 득량만에서 발생한 Chattonella 적조 시료를 대상으로 단일 세포를 분리하고, 이들 시료의 28s rDNA, rbcL, psaA영역을 대상으로 single-cell PCR 기법을 이 용하여 종 동정을 실시하였다. 현미경 관찰 결과 일반적인 Chattonella와 유사한 형태적 특징을 보였으나 세포 크기 및 형태만으로는 종 식별이 어려웠다. 28s rDNA, rbcL, psaA 영 역을 대상으로 한 염기서열 비교 결과에서는 세 영역 모두 에서 C. marina, C. marina var. antiqua, C. marina var. ovata와 높은 서열 유사성을 보여 C. marina 혹은 아종이 득량만에서 출현함을 확인하였다.