1.서 론

로티퍼는 크기 및 형태가 자치어의 먹이로서 적당하기 때 문에, 유용어류의 종묘생산용 초기 먹이로서 널리 이용되고 있다. 그 배양 기술도 발전하여 다양한 배양 기술이 개발되 어(Hirayama and Ogawa, 1972; Fu et al., 1997; Fielder et al., 2000; Altaff and Janakiraman, 2015; Önal et al., 2015), 안정적으 로 대량 생산이 가능해져 양적인 문제도 해결되었다. 로티 퍼의 영양학적인 측면과 배양방법에 대하여 다양한 연구가 진행되어 왔으며(Theilacker and McMaster, 1971; Fu et al., 1997; Takeuchi, 2001; Tomoda et al., 2007), 수온과 염분의 환경 변화에 의한 로티퍼의 증식률 상승에 대한 연구도 진행되어 왔다(Ito et al., 1981; Miracle and Serra, 1989; Snell, 1992; Hagiwara et al., 1995; Altaff and Janakiraman, 2015).

대부분의 해산어의 종묘생산은 수온 16~22°C의 해수(염분 농도 32-34)를 이용하고 있으며, L-type 로티퍼의 경우 수온 20~25°C에서 증식을 시키고 있다(Ito et al., 1981). 이러한 수 온 환경의 자어 사육수조에 고수온, 저염분에서 배양한 로 티퍼를 공급하면, 수온과 염분조건의 차이에 영향을 받은 로티퍼는 쇠약해져 폐사하게 된다(Lubzens, 1987; Øie andOlsen, 1993). 폐사한 로티퍼는 부패하여 수질 악화로 인해 자어기 초기 폐사의 원인이 될 수 있다. 이를 피하기 위해서 일반적으로 로티퍼 배양 시 수온과 염분은 종묘생산 수조의 사육 조건에 비슷하게 유지하고 있다. 국내에서는 대구 자어 사육 시 로티퍼 배양 수온을 28°C에서 25°C로 낮추고 20°C에 서 영양강화를 하여 10°C 내외의 사육수조에 공급하기도 하 였다(Seo et al., 2007). 하지만, 냉수성 어종에 적합한 로티퍼 의 배양기술과 영양강화 방법은 아직까지 확립되어 있지 않 은 실정이다. 이를 보완하기 위해서 n-3 HUFA와 같은 지방 산의 영양강화 및 로티퍼의 사육수온 보다 낮은 수온에서 영 양강화하여 먹이공급을 시도하고 있으나(Reitan et al., 1997; Cahu et al., 1998; Assavaaree et al., 2001), 아직도 해결해야 할 문제가 많다.

EPA(eicosapentaenoic acid)와 DHA(docosahexaenoic acid) 같은 n-3 계열 지방산은 생체조절 기능에 있어 자어의 초기 성장 과 생존에 중요한 역할을 한다. 그리고 highly unsaturated fatty acids(HUFA)는 생체막의 유동성 및 효소활성을 변화시키고, prostaglandin의 전구물질 등 그 역할이 매우 중요한 것으로 알려져 있다.

육상 동물과는 달리 어류의 경우, 일반적으로 필수지방 산의 질적 및 양적 요구량은 어종, 온도 및 염분 등에 따라 달라질 수 있다(NRC, 1993). 담수어류는 Linoleic acid(LA, C18:2n-6)과 Alpha-linolecic acid(ALA, C18:3n-3)을 전구 지방산 으로 하여 체내에 필요로 하는 EPA나 DHA의 합성이 가능하 지만, 해산어류는 EPA나 DHA와 같은 n-3 HUFA(n-3 highly unsaturated fatty acids)를 합성하는데 필요한 효소가 극히 제 한적이거나 없기 때문에 먹이에 EPA와 DHA를 보충해 주어 야 한다.

본 연구에서는 냉수성 어류의 종묘생산시 초기 먹이로 공 급하여 성장과 생존율을 향상시키기 위하여, 10°C의 수온에 서도 증식 능력과 활력을 갖는 로티퍼를 배양하고, 이 로티 퍼를 사용하여 적합한 영양강화 수온, 시간, 영양강화제의 선택에 필요한 기초 자료를 제공하고자 하였다.

2.재료 및 방법

2.1.로티퍼의 저수온 순치 배양

자연 환경에 있어서 냉수성 어류의 산란기는 주로 12~4월 로 알려져 있으며, 이 때 수온범위는 5~10°C로 보고되어 있 으며(Nakatani, 2008), 부화한 자어를 사육 할 때에도 이 수온 대가 적합하다. 그러나 이 수온에서 로티퍼를 초기 먹이로 유용하게 이용하기 위해서는 표층에 부유하는 자어가 항상 섭취할 수 있는 상태로 사육수조 내에서 로티퍼의 활력이 필요하다. 그래서 냉수성 어류의 종묘생산을 고려하여 이러 한 조건을 충족시키기 위해 저온에서도 증식 능력과 운동 능력을 가진 저온 내성 로티퍼를 배양하였다.

실험에 사용한 로티퍼는 2015년 강릉원주대학교에서 분 양받은 L-type 로티퍼(Brachionus plicatilis, 울진 strain)로 1톤 배양수조에서 수온 22~23°C, 염분농도 18~20 ppt으로 계대 배 양한 것을 사용하였다. 먹이로는 담수산 농축 클로렐라 (Chlorella vulgaris, ㈜대상)를 2,000개체 당 1일 건조중량 2 mg 이 되도록 공급하였다.

로티퍼의 저수온 순치 배양은 저온성 먹이생물 배양 장치 (특허 제10-1634354호)를 이용하였다. 이 배양장치는 내부 사 육수조(Ø600×550 mm, 약 155 L)와 외부수조로 구성되어 수온 이 조절된 물을 외부수조로 순환시켜 내부 수조의 수온을 조절하고 유지할 수 있는 2중 구조의 수조이다. 본 장치를 사용하여, 20°C에서 로티퍼를 배양하기 시작하였다. 1개월에 수온 1°C씩 낮춰 활력이 좋은 로티퍼를 선별하여 1차적으로 15°C에서 3개월간 배양하였다. 이 후부터는 1개월에 수온을 1°C씩 낮추며 활력이 좋은 로티퍼의 선별을 계속하여 2차적 으로 10°C에서 3개월 이상 배양하였다. 실험에는 10°C에서 3 개월 이상 배양한 로티퍼를 사용하였다. 실험에 사용한 해 수는 여과해수를 사용하였고, 염분 농도는 20으로 일정하게 조절하였다. 사육기간 동안 배양수조 내에는 수온 데이터 로거(Onset HOBO, U-22-001, USA)를 설치하여 수온을 기록하 였다.

2.2.수온 및 영양강화

영양강화는 10, 15, 20°C로 조절된 인큐베이터(Cryste, ㈜노 바프로, Korea)에서 원형 배양수조(Ø220×220 mm, 약 6 L)에 염 분농도 20ppt의 배양수를 준비하여 개체밀도가 5,000개체/ml 가 되도록 접종하였다.

실험에 사용한 영양강화제는 상업적으로 이용되는 A(A사), S(I사), SCV(C사), SCP(C사)를 각각 50 ml/억, 17 g/억, 300 ml/억, 7 g/억의 용량으로 사용하였다.

로티퍼 시료는 영양강화 전, 영양강화 후 6, 12, 24시간 별 로 샘플링하여 40 μm체에 걸러서 담수로 세척한 후 15 ml tube 에 넣고 분석 시까지 – 20°C에 보관한 것을 사용하였다.

2.3.로티퍼 및 영양강화제의 지방산 분석

지방산 분석은 Folch et al.(1957)의 방법에 따라 클로로 포름과 메탄올 혼합액(2:1)으로 총 지질을 추출하여 14 % BF3-methanol(Sigma, USA) 용액으로 지방산을 methylation 시 킨 후, capillary column(SPTM-2560, 100 m × 0.25 mm i.d., film thickness 0.20 μm, USA)이 장착된 gas chromatography(Perkin Elmer, Clarus 600, USA)로 지방산을 분석하였다. Carrier gas는 헬륨을 사용하였으며, Oven 온도는 최초 140°C에서 240°C까 지 4°C/min 증가시켰다. 이때, injector 온도는 240°C, detector (FID) 온도는 240°C로 각각 설정하였으며, 표준 지방산으로 37개 지방산 혼합물(PUFA 37 Component FAME Mix, USA)을 사용하였다.

3.결과 및 고찰

3.1.로티퍼의 저수온 순치 배양

일반적인 배양수온보다 낮은 수온에서 순치 및 선별 과 정을 거친 로티퍼는 10°C에서 50일간 배양한 결과, 최초 접 종밀도 350±7.9개체/ml에서 최종 배양밀도 1,064±5.7개체/ml (최대 1,794/ml)로 개체수가 약 3배 증가하는 증식률을 보였 다(Fig. 1). 일반적인 로티퍼 배양 수온(20~25°C)(Ito et al., 1981)은 냉수성 어류의 부화 자어 사육 수온(5~10°C)과 수온 차이가 너무 크기 때문에 사육 수조에 공급한 로티퍼가 유 용하게 먹이로 이용되지 않는다고 생각된다(Lubzens, 1987; Øie and Olsen, 1993). 이러한 로티퍼 배양은 자어 사육과 환 경 조건이 다르기 때문에, 사육수조에 공급되는 로티퍼는 필연적으로 급격한 환경 변화에 노출된다. 로티퍼는 운동에 많은 대사 에너지를 사용하기 때문에(Epp and Lewis Jr, 1980), 급격한 환경의 변화는 대사 기능에 대한 영향을 주어 유영 력 저하로 이어진다. 로티퍼의 증식 가능한 수온 범위는 5°C 이내의 변화(Fielder et al., 2000)이며, 염분의 경우 비교적 영 향을 적게 받아(Koiso and Hino, 2001) 급격한 변화가 아니면 내성이 높아 염분 농도 1~97 ppt의 넓은 범위의 염분에 내성 이 있다(Epp and Winston, 1977; Walker, 1981).

하지만, 본 실험에서는 냉수성 어류의 사육 수온과 유사한 수온에서도 증식을 보여주었다. 본 실험은 약 155 L의 소규모 수조에서 이루어졌기 때문에 대량 배양은 실시하지 않았다. 실제 종묘생산 시 로티퍼를 이용할 경우 10°C에서 연속 배 양하고, 1차 배양 수조의 용량과 배양 밀도를 올림으로써 종 묘생산 시 필요한 로티퍼 양을 생산할 것으로 기대된다.

3.2.수온 및 영양강화제에 따른 지방산 분석

EPA 및 DHA와 같은 n-3 HUFA의 함량은 해산 어류 자어 의 정상적인 성장과 생존에 많은 영향을 미친다(Rainuzzo et al., 1989; Watanabe, 1993; Furuita et al., 1996; Rainuzzo et al., 1997; Furuita et al., 1998). 부화 자어가 건강하게 성장하기 위 해서는 먹이생물의 n-3 HUFA 함량이 3~4 % 이상을 요구한 다(Yoshimatsu et al., 1997).

본 실험에서 사용한 영양강화제 네 종류의 지방산 조성을 Table 1에 나타내었다. 포화지방산의 일종인 Palmitic acid (PA, C16:0)은 A에서 높은 값을 보여주었다. 한편, ALA는 SCV와 SCP에서만 값이 나타났다. 또한, n-3계 고도불포화 지 방산인 EPA는 SCP에서 15.49 %로 높게 나타났으며, DHA는 SCP 35.03 %, S 22.32 %순으로 높았다. EPA와 DHA의 비율은 15.49, 35.03 %로 powder type인 SCP에서 높게 나타났다.

한편, 10°C에서 배양한 로티퍼의 영양강화 전 지방산 분 석결과를 Table 2에 나타내었다. PA는 13.63 %, LA는 44.07 % 로 높게 나타났다. 한편, EPA 및 DHA는 각각 0.36 %, 0.37 % 로 낮게 나타났다.

각각의 영양강화제를 사용하여 영양강화 수온 및 시간에 따른 로티퍼의 지방산 조성을 Table 3~6에 나타내었다.

우선, Table 3의 A에서는 LA가 영양강화 수온 및 시간에 관계없이 37.63~48.04 %로 높은 비율을 차지하였다. PA는 20°C에서 12시간 영양강화 한 실험구가 19.26 %로 높게 나타 났다. ALA는 10°C에서 6시간 영양강화한 실험구가 4.70 %로 높게 나타났다. Arachidonic acid(AA, C20:4n-6)는 수온 10, 15°C 에서 24시간, 20°C에서 12시간 영양강화한 것이 각각 1.94 %, 2.00 %, 1.91 %로 나타났다. EPA는 20°C에서 24시간 영양강 화 실험구가 1.58 %, DHA는 20°C에서 12시간 영양강화한 실 험구가 4.79 %로 나타났다.

영양강화제 S를 사용하여 영양강화한 로티퍼의 수온 및 시간에 따른 지방산 함량을 Table 4에 나타내었다. LA가 전 체 지방산 함량 중에서 가장 높은 비율을 차지하였으며 그 다음으로 PA가 차지하였다.

ALA는 10°C 실험구가 시간별로 4.03, 4.42, 3.48 %로 다른 수온보다 높게 나타났다. AA는 20°C에서 6시간 영양강화 한 실험구가 0.82 %를 나타냈으나 12시간, 24시간 실험구에서는 0.0 %로 나타났다. EPA는 15°C에서 6시간 영양강화한 실험 구가 3.57 % 높았으며, DHA는 15°C에서 24시간 영양강화한 실험구가 12.40 %로 높게 나타났다.

SCV를 사용하여 영양강화한 로티퍼의 시간 및 수온에 따 른 지방산 함량을 Table 5에 나타냈다. LA가 전체 지방산 함 량 중 가장 높은 비율을 차지하였다. ALA는 10°C에서 24시 간 영양강화한 실험구가 7.82 %, AA는 15°C에서 6시간 영양 강화한 실험구가 1.51 %로 높게 나타났다. EPA와 DHA는 15°C에서 6시간 영양강화한 실험구가 각각 2.33 %, 4.46 %로 높게 나타났으며, 영양강화 시간이 길어질수록 낮아지는 경 향이 나타났다.

SCP를 사용하여 영양강화한 로티퍼의 시간 및 수온에 따 른 지방산 함량을 Table 6에 나타냈다.

LA가 전체 지방산 함량중 높은 비율을 차지하였으며, PA 가 다음 순으로 높았다. ALA는 20°C에서 영양강화 시간에 따라 6.06, 6.45, 6.64 %로 다소 높아지는 경향을 나타났다. AA는 15°C 6시간, 12시간 영양강화 실험구를 제외하고 비슷 한 비율을 나타냈다. EPA는 20°C 24시간 실험구에서 3.78 %, DHA는 20°C 실험구에서 영양강화 시간이 길어질수록 4.97, 5.00, 6.98 %로 나타났다.

본 실험에서 사용한 네 가지의 영양강화제의 지방산 조성 은 SCP의 EPA, DHA 함량이 15.49, 35.09 %로 높았다(Table 1). 하지만, 로티퍼에 직접 영양강화를 하였을 경우에는 DHA 함량은 S에서 높게 나타났으며, 영양강화 시간과 수온이 높 을수록 높게 나타내었다(Table 4). 이는 oil type의 S가 powder type의 SCP보다 로티퍼 체내에 농축이 쉽기 때문으로 사료 된다.

각각의 영양강화제로 영양강화한 로티퍼의 전체 지방산 함량 중 EPA와 DHA의 함량을 영양강화 시간 및 수온별로 비교해보면, EPA는 SCP가 영양강화 수온과 시간에 관계없 이 2 % 이상을 차지하여 다른 영양강화제보다 전체적으로 높은 비율을 나타냈다. DHA는 S가 다른 영양강화제보다 높 게 나타났으며, 15°C-24시간 실험구에서 12.40 %, 영양강화 시간이 길어질수록 비율이 높아졌다. 그 다음으로 SCP를 20°C 에서 24시간 영양강화 한 실험구가 6.98 %로 나타났다. 한편, 저온에서 순치시킨 로티퍼는 약 20°C 정도의 온도변화에도 14일간 50 %가 살아남는다(Assavaaree et al., 2001).

결과적으로 냉수성 어종의 초기 먹이로서 로티퍼를 유용 하게 활용하기 위해서는 부화 자어의 사육수온인 10°C에서 배양한 로티퍼에 EPA와 DHA의 지방산 함량이 높은 S와 SCP를 어종의 영양 요구량에 맞는 비율로 영양강화 후 사육 수조에 공급하는 것이 효과적일 것으로 판단된다.

4.결 론

본 연구에서는 냉수성 어류의 종묘생산시 초기 먹이로 공 급되는 저온 내성을 가진 로티퍼의 배양과 이에 적합한 영 양강화 방법에 대하여 검토하고 고찰하였다.

본 연구의 주요 결론은 다음과 같다.

이러한 결과는 냉수성 어류의 종묘생산 시 자어 사육환경 에 맞는 저온성 로티퍼에 적정 영양강화를 통하여 초기 먹 이로서 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

향후, 영양강화제의 비율별로 영양강화제를 사용하여 저 온에서 배양한 로티퍼의 지방산 함량을 분석하고, 이를 통 해 자어에 공급시 어떠한 비율로 영양강화를 하는 것이 좋 을지 검토해 볼 필요가 있다. 또한, 여기서 얻은 결과를 토 대로 자어에 공급 후 자어에 대한 지방산 함량에 대해서도 알아볼 필요가 있다.