1.서 론
영양염 중 질소(nitrogen)는 식물플랑크톤의 주요 생체 구성 성분이며 식물생장에 필수적인 원소이다(Ryther and Dunstan, 1971). 해양에서 질소는 용존 무기 질소(dissolved inorganic nitrogen; DIN)와 용존 유기 질소(dissolved organic nitrogen; DON) 로 구분되며, DIN은 질산염(nitrate; NO3--N), 아질산염(nitrite; NO2--N)과 암모늄(ammonium; NH4--N)이 포함되고, DON의 경 우 다양한 분자량의 화합물이 존재하지만, 화학적 조성이 명 확하게 잘 알려져 있지 않다(Antia et al., 1991). 이러한 DON 은 식물플랑크톤 섭식과정, 배설물 및 담수와 대기 유입으 로 공급된다(Bronk and Steinberg, 2008). 이 중 저분자 DON인 아미노산(amino acid)과 요소(urea)는 식물플랑크톤의 생장에 중 요한 질소 공급 인자로 알려져 있다(Antia et al., 1991; Worshold et al., 2008; Hansell and Carlson, 2014). 일반적으로 식물플랑크 톤은 생장에 DIN을 이용하지만, DIN이 제한된 환경에서는 다양한 형태의 DON을 가수분해하여 생장에 이용하며, 결국 종천이(species succession)를 유도하는 중요한 구성인자로 판 단된다(Leong and Taguchi, 2004; Zhang et al., 2015).
DON 중 중요한 비율(~ 15 %)을 차지하는 아미노산은 식물 플랑크톤의 생장에 직간접으로 영향을 미치며(Sharp, 1983; Keil and Kirchman, 1991; Dittmar et al., 2001), 아미노산 중 글 리신(glycine)은 식물플랑크톤의 체내 아미노산 비율 중 우점 성분으로 알려져 있고, 동시에 해수에서도 높은 농도로 존 재한다(Cowey and Comer, 1963). 또한 요소(urea)는 식물플랑 크톤 생산에 중요한 요인으로(Dugdale and Goering, 1967), 해 양에서 1 μM 이하의 농도이나 식물플랑크톤 주요 영양 물질 이고, 재생산 질소의 중요한 근원이 된다(Antia et al., 1991; Berman and Bronk, 2003).
한편, 동해 남서해역의 혼합층에서 DIN의 농도는 2 μM 이 하의 낮은 농도이며, DIN : DIP 비 역시 10 이하로 식물플랑 크톤 생장에 대해 DIN이 제한된 해역으로 알려져 있다(Kim et al., 2010; Kim and Kim, 2013; Kwon et al., 2014). 하지만 동 해 중·남부해역의 용존 총 질소(dissolved total nitrogen; DTN) 중 DON의 구성 비율은 시·공간적으로 변화는 하지만, 50 % 이상을 차지하며(남부해역의 경우 70 %까지; Kim and Kim, 2013; Kwon et al., 2014), 동해 남부해역의 표층 아미노산의 농도는 DIN의 농도와 유사한 수준이다(Park et al., 1995). 또 한 식물플랑크톤은 DIN이 제한된 환경에서 상대적으로 높 은 비율로 존재하는 DON을 이용하는 경향이 강하다(Gilbert et al., 1991). 본 연구에서는 동해 남서해역에서 우점하는 식 물플랑크톤 Chaetoceors debilis와 Leptocylindrus danicus를 분리 하여 질소화합물의 이용성에 대한 정량적인 평가를 수행하 였고, 그 결과를 바탕으로 동해에서 2종에 대한 DON을 이용 한 우점화 전략을 토의하였다.
2.재료 및 방법
2.1현장 조사
동해 남서해역의 식물플랑크톤 군집구조 및 우점종을 확 인하기 위해서, 2014년 5월 7일부터 10일까지 부경대학교 탐 사선인 탐양호(R/V Tamyang)를 이용하여 현장 관측을 실시 하였다(Fig. 1). 총 12개 정점의 표층 해수를 채수하였으며, 채수 즉시 해수 1 L를 Lugol’s solution으로 최종 농도가 1 %가 되게 고정시켰다. 침전법으로 암소에서 농축한 후, 상등액을 제거하여 최종적으로 10 mL가 되게 농축하였다. 이후 농축된 시료를 균일하게 혼합하여Sedgewick-Rafter conunting chamber 에 시료 0.1 mL를 취하여 도립위상차현미경(TE-2000, Nikon, Japan)을 이용하여 동정하였다. 식물플랑크톤의 분류 및 동 정은 Chihara and Murano(1997)와 Tomas(1997)의 참고문헌을 이용하였다.
2.2우점 식물플랑크톤의 분리 및 유지배양
동해 남서해역에서 우점 식물플랑크톤의 단일 배양세포를 확보하기 위하여, 현미경 하에서 pasteur pipette(Ø50~100 μm)으 로 직접 순수 분리 하였다. 분리된 세포는 여과해수(0.22 μm pore size, Millipore GSWP)를 이용하여 3~4회 반복 세척하여 배양튜브(TB-2800, Tokyo, Japan)에 이식하였다. 유지배양에 사용된 배지는 동해 외양수를 바탕으로 한 f/2 배지이며, 0.001 μM selenium (H2SeO3)을 첨가하여 사용하였다(Guillard and Ryther, 1962; Doblin et al., 1999). 또한 분리된 우점종은 실 험에 사용되기 전 AM9 항생제를 이용하여 무균화 작업을 수 행하였으며(Provasoil et al., 1959), 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 검사를 통하여 검증하였다(Poter and Feig, 1980). 실험 에 사용된 기구는 오염을 차단하기 위해 고압멸균(120℃, 30 min) 후 사용하였으며, 모든 실험은 clean bench에서 수행하 였다.
2.3질소 제한 하에서 우점 식물플랑크톤의 생장동력학 실험
세포밀도의 증감은 현미경을 이용한 직접 검경이 아닌 형 광광도계(Model-10-AU-005, Turner Designs, USA)의 in vivo chlorophyll 형광값을 활용하였다. 세포밀도와 in vivo chlorophyll 형광값의 관계를 파악하기 위해, 20℃, 30 psu의 조건 하에서 대수생장기까지 배양하였다. 이후 희석을 통하여 여러 단계 의 세포밀도를 조제하여, 형광광도계로 형광값을 측정하였 다. 세포밀도는 in vivo chlorophyll 형광값과 세포밀도의 높은 상관관계로부터 계산하였다(Fig. 2).
질소화합물에 대한 생장속도를 파악하기 위하여 DIN 2종 (질산염과 암모늄), DON 2종(글리신과 요소)를 이용하였다. 글리신의 경우, 동해 남부해역의 아미노산 분포에서 높은 농도로 나타났으며(Park et al., 1995), 요소는 일반 해양에서 식물플랑크톤의 주요 영양물질로 알려져 있다(Antia et al., 1991; Berman and Bronk, 2003). 배양 실험시 우점종의 생장에 질소 이외에 다른 요인의 간섭을 최소화하기 위해 질소고갈 영양염 강화 L1 배지를 이용하였다. 각각의 질소화합물은 질소 최종농도가 1, 3, 5, 10, 50, 100, 300 μM의 총 7단계가 되 도록 조제하였으며, 세포내 질소가 고갈된 세포를 100 cells mL-1가 되도록 접종하였다. 배양 실험은 수온 20℃, 30 psu의 조건에서 수행되었으며, 접종 직후를 포함하여 이틀 간격으 로 동일한 시간에 in vivo chlorophyll 형광값을 측정하였고, 생장속도는 식(1)에 의해 계산하였다.
N0, Nt:
대수생장기에서 초기와 t시간 후의 세포밀도 (cells mL-1)
Δt:대수생장기의 기간(day)
영양염과 생장속도의 관계는 Monod 식에 대입하여 영양 염 농도의 의존성을 정량적으로 파악하였다(Dugdale, 1967). 그리고 변수인 반포화상수(Ks)는 식(2)에 대입하여 비선형최 소자승법으로 계산하였다.
μmax:
최대 생장속도(day-1)
Ks:반포화상수(μM)
S:영양염 농도(μM)
3.결과 및 고찰
3.1동해 남서해역에서 Chaetoceros debilis와 Letpocylindrus danicus의 우점
조사 기간 동안 동해 남서해역에서 출현한 식물플랑크톤 의 현존량은 전 정점에서 9.0 × 103 ~ 68 × 104 cells L-1(평균 19±18 × 105 cells L-1)으로 나타났으며, D1정점에서 가장 높은 현존량을 보였다. 식물플랑크톤의 군집구조를 살펴보면, 규 조류가 전 정점에 걸쳐 약 95 % 이상 극우점 현상을 보였다. 그 중 C. debilis(6~78 %)와 L. danicus(8~80 %)에 의한 우점 현 상이 뚜렷이 나타났다(Table 1).
본 연구해역에서 식물플랑크톤의 현존량은 정점 간 차이 를 보였지만, 전반적으로 다소 높은 세포밀도가 나타났다 (Table 1). Shim et al.(2015)은 동해 연안 식물플랑크톤의 계절 별 변동을 확인해본 결과 춘계 대번식이 발생하는 5월에 가 장 높은 식물플랑크톤 현존량이 확인되었다. 이는 조사가 이루어진 춘계의 경우, 동계에 깊게 형성된 혼합층으로 인 해 표층으로의 풍부한 영양염 공급과 춘계에 일조량 증가로 인한 식물플랑크톤의 활동이 증가한 결과로 판단되어진다. 또한 본 연구해역의 식물플랑크톤 우점군집은 규조류이며, Shim et al.(1994)에서 춘계 동해 남부해역 식물플랑크톤 우점 군집을 규조류(약 98 %)로 보고하였고, 우점종은 L. danicus와 Pseudo-nitzschia pungens이었다. Kim et al.(2014)도 춘계 동해 남부연안에서 L. danicus가 최상위 우점종(약 86 %)으로 보고 하였다. Shim et al.(2015)는 동해 남부연안에서 Chaetoceros 속 이 가장 많은 출현 종수를 보였으며, C. affinis와 C. didymus 가 우점종으로 출현하였다고 보고한바 있다. 우점종인 C. debilis는 온대성 연안종으로 우리나라에서는 연중 출현하는 것으로 알려져 있으며, L. danicus는 온대 연안종으로 협염성 의 특징을 보이며, 주로 4~6월에 표층에서 대발생하는 것으 로 알려져 있다(Shim et al., 1994; Werner, 1997). 결과적으로 춘계 동해 남서해역에서 본 연구결과 확인된 C. debilis와 L. daniucs와 같은 규조류 군집이 식물플랑크톤 환경에서 중요 할 것으로 생각된다.
3.2질소 제한 하에서 우점 식물플랑크톤의 생장동력학 실험
현장자료를 토대로 실내 배양 실험에서는 우점종으로 나 타난 규조류 C. debilis와 L. danicus를 이용하여 생장동력학 실험을 실시하였다.
C. debilis의 생장속도는 4종의 화합물 농도가 50 μM까지 증가할수록 증가하였으며, 그 이상의 농도에서는 일정하였 다(Fig. 3). 유도된 생장식으로부터 μmax는 질산염이 1.50 day-1, 암모늄이 1.13 day-1, 글리신이 1.46 day-1, 요소가 0.93 day-1로 나 타났으며, Ks의 경우, 각각 1.62, 6.97, 3.36, 0.55 μM로 나타났다 (Fig. 3). L. danicus도 C. debilis와 마찬가지로 질소화합물 모두 농도가 50 μM까지 증가할수록 생장속도 역시 증가하였으며, 그 이상의 농도에서는 생장속도가 일정하게 나타났다(Fig. 4). 암모늄(1.57 day-1)에서 가장 높은 생장속도가 나타났으며, 다음으로 질산염(1.55 day-1), 글리신(1.47 day-1), 요소(1.42 day-1) 순으로 낮아졌다. 대표적인 연안역에 우점하는 규조류의 μmax와 비교를 하여보면, 큰 차이는 보이지 않았다(Table 2). Ks의 경우, 질산염(5.21 μM)에서 가장 높은 농도였으며, 암모 늄(4.57 μM), 글리신(3.80 μM), 요소(1.94 μM) 순으로 나타났다 (Fig. 3). 두 종 모두 무기태 질소에서 다소 높은 생장속도였 지만, DON에서도 DIN정도의 생장속도가 나타났다. C. debilis 와 L. danicus의 질소화합물에 대한 Ks는 요소에서 가장 낮게 나타났다. 일반적으로 Ks는 제한 영양염에 대한 친화성(affinity) 을 나타내는 지표로 사용되어지며(Dugdale, 1967), 이 값이 낮 을수록 낮은 영양염에 대한 친화성이 높다.
Fisher and Cowdell(1982)의 보고에 의하면, 8 종의 해양규 조를 대상으로 요소와 아미노산 7종에 대하여 정치배양을 실시한 결과 DIN 뿐만 아니라 DON에서도 잘 생장하였고, 호주 Bass 해협에서 DON이 DTN중 97 % 차지하여 DON의 중 요성을 제시하였다. Chesapeake 만과 Baltic 해의 경우 규조류 의 대발생이 DIN이 급격히 고갈되고, DON의 농도 및 비율 이 증가될 때 종천이 양상이 발견된다고 보고되었다(Gilbert et al., 1991). Zhang et al.(2015)은 동해 남서해역의 해양환경에 많은 영향을 주는 동중국해에서 DON 중 아미노산(자유 아미 노산 및 결합 아미노산)이 와편모조류로의 천이에 영향을 주 었다고 하였으며, Kwon et al.(2013)은 유해 적조 Alexandrium tamarense와 A. catenella의 생장과 우점전략에서 DON이 중요한 역할을 보고하였다. 아울러 Prorocentrum minimum은 요소에서 높은 친화성이 확인되었으며(Table 3), Cochlodinium polykrikoides (Gobler et al., 2012)과 P. donghaiense(Hu et al., 2014) 또한 요소 에서 무기질소 만큼 빠른 생장을 보인다고 보고된 바 있다. 따라서 DON은 규조류뿐만 아니라 와편모조류의 생장과 대 발생에도 영향을 미치는 것으로 보인다.
이전 많은 연구들을 통해 동해는 식물플랑크톤의 생장에 대해 질소가 제한 영양염으로 작용하는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., 2010; Kim and Kim, 2013; Kwon et al., 2014). 일반 적인 해양에서 질소계 영양염은 강우(precipitation), 수직 확산 (upward diffusion), 질소 고정(nitrogen fixation)과 같은 신생산(new production)과 유광층내 미생물의 재무기화 작용(remineralization) 을 포함한 생물학적 재생산(regenerated production)으로 공급 되어진다(Dugdale and Georing, 1967; Eppley and Peterson, 1979; Carpenter and Romans, 1991; Duce et al., 1991). 동해 남서해역 에서 식물플랑크톤 생장에 대한 무기 질소 제한 상태를 극 복하기 위하여, 수직 확산에 의한 신생산과 유광층내 생물 학적 재생산이 주요한 질소 공급 경로로 알려져 있다(Chung et al., 1989; Moon et al., 1998; Kwak et al., 2013). 본 연구에서 규조류 C. debilis와 L. daniucs의 생존전략인 DON 이용은 아 직까지 동해의 DON의 정량과 정성분석을 수행하지 못하여, 우점종의 우점 및 생존전략을 보다 정확히 파악하기에는 어 려움이 있다. 하지만, 동해 남서해역에서 DTN 중 DON의 농 도 및 구성비가 높게 나타나는 것으로 알려져 있어(Kwon et al., 2014), 다양한 경로의 질소원이 공급원뿐만 아니라 식물 플랑크톤의 DON의 높은 이용성은 본 해역의 높은 기초 생 산력을 유지하는 중요한 요인이 될 것이다.
4.결 론
본 연구는 동해 남서해역과 같이 DIN 제한환경에서 우점 규조류 C. debilis와 L. danicus의 생존 및 우점 전략을 살펴보 았다. 2 우점종을 이용하여 무기 질소 2종(질산염, 암모늄)과 유기 질소 2종(글리신, 요소)에 대한 Monod 식을 바탕으로 생장동력학 실험을 수행한 결과, 무기질소 뿐만 아니라 유 기 질소에서도 높은 생장속도가 나타났다. 또한 C. debilis와 L. danicus는 요소에서 가장 높은 친화성을 보여, 동해 남서 해역과 같이 무기질소가 제한된 해역의 경우, 용존 유기 질 소의 효율적인 이용은 규조류의 생존 및 우점화 전략에 중 요한 요인으로 작용할 가능성을 시사하였다.
