1.서 론

산업기술의 발달과 함께 국가 간의 교역이 활발해 지면서 수송수단인 선박의 중요성 또한 커져왔다. 물적 교류의 양과 빈도가 증가함에 따라 위험·유해물질(HNS ; Hazardous and Noxious Substances)을 운송하는 선박의 유출사고로 인한 생 태적, 경제적 및 인체 건강에 대한 부정적인 문제들이 빈번하 게 발생하고 있다. 이에 따라 국제해사기구(IMO ; International Maritime Organization)에서는 기존의 기름오염사고 대비·대 응 및 국제 협력에 관한 협약(OPRC ; International Convention on Oil Pollution Preparedness, Response and Co-operation, 1990)에 HNS를 포함하여 2000년 3월, 위험·유해물질 오염사고 대 비·대응 및 협력에 관한 의정서(Protocol on Preparedness, Response and Co-operation to pollution Incidents by Hazardous and Noxious Substances, 2000)를 채택하였고, 발효요건의 충족 에 따라 2007년 6월 14일에 국제적으로 발효되었다. 그러나 이에 대한 국내 대응체제는 아직 초기단계로 국내 연구나 정책이 미흡한 실정이다(Choi and Lee, 2009).

우리나라는 1,000여종의 HNS가 해상으로 운송되고 있으 며, 산업 활동에 비례한 해상 운송량의 지속적인 증가와 함 께 사고 위험성도 증가함에 따라 대형 HNS 오염사고 발생 시 범국가적 차원의 신속하고 효율적으로 대응할 수 있는 사고대응 체제 구축이 필요하게 되었다(Choi, 2002). 미국의 경우, HNS 사고발생 시 대응시스템의 일환으로 대응에 필요 한 전문기술지원은 부처별 임무와 특성에 따라 국가기동타 격대, 환경대응팀 및 과학기술지원팀 등으로 세분화하여 지 원한다. 특히 환경대응팀은 사고대응 요원의 훈련, 시료채취 및 분석, HNS의 인체 및 환경위해성평가 등에 대한 전문기 술을 지원한다(Choi and Lee, 2009). 반면 국내에서는 최근에 발생한 우이산호, 한양 에이스호 등 잇따른 HNS 사고의 환 경대응과 관련하여 이러한 사고가 실질적으로 사고해역의 해양생물에게 미치는 영향을 평가하기 위한 기술이 미흡한 실정이다. HNS 유출사고가 미치는 해양환경영향과 관련한 과거 연구사례들은 주로 해양 수질 및 해저 퇴적물 등 일반 적인 이화학적 방법에만 중점을 두었으며 실제 생물의 영향 과 관련된 연구는 기존의 물질 데이터베이스의 생물 독성값 을 활용하거나 특정 한 종을 이용한 실험적 접근방법이 유 일하였다(Kim et al., 2014; Lee et al., 2013; Neuparth et al., 2013; Rocha et al., 2016).

따라서 본 연구에서는 HNS 유출사고 대응 체제 구축의 일환으로 최근 이스턴 브라이트호 및 한양 에이스호 사고의 사례를 바탕으로 대표적인 HNS 중 하나인 질산의 유출사고 가 해양생물에게 미치는 정량적인 영향을 평가하기 위해 국 내외로 표준화된 독성시험법을 선정하였고 실제 각 영양단 계를 대표하는 해양생물을 이용한 생물독성시험을 수행하 여 실제 HNS 사고해역의 이화학적 모니터링에 국한된 현재 의 대응시스템을 보완할 수 있는 대안으로써 활용하고자 하 였다.

2.재료 및 방법

2.1.시험물질

질산(HNO₃)은 수중으로 유입되면 쉽게 이온화 되어 질산 염(NO₃^-)을 형성하고 히드로늄이온(H₃O⁺)을 형성한다. 또한 수중환경에서의 다량의 산 유출은 히드로늄이온의 농도가 증가함에 따라 수중 pH는 급격히 낮아지게 된다(Lee et al., 2013). 그러므로 본 연구에서는 질산(HNO₃) 유출사고 직후, 선박 인접해역의 pH 변화에 대한 생물독성 영향평가를 위 해, HNO₃(70 %, Sigma-Aldrich)를 1 N 농도로 제조 후 모든 시 험 용액을 pH 8(대조구), 7, 6, 5, 4 및 3으로 설정하였다. 또 한 질산에서 해리된 질산염 농도변화에 대한 생물독성 영향 평가를 위하여 질산나트륨(NaNO₃, Sigma-Aldrich)을 시험물질 로 이용하였고 농도범위설정시험 결과를 바탕으로 세부 농 도를 설정하여 본 시험을 수행하였다(Table 1). 모든 시험에 이용된 해수는 오염되지 않은 자연해수를 망목 1 μm의 C.P. 필터를 이용하여 여과한 후 121°C에서 15분간 고압증기 멸 균하여 이용하였다.

2.2.시험생물 및 시험방법

시험생물은 해양생태계(수계) 내의 각 영양단계를 대표하 는 식물플랑크톤, 동물플랑크톤 및 어류의 분류군들에서 한 종씩을 선정하였으며 퇴적물 독성시험을 위해 발광박테리 아와 저서성단각류를 각각 한 종씩 선택하였다. 시험생물은 모두 국제표준시험규격 및 국내 해양환경공정시험기준에 제시되어 있는 종들로서, 본 시험 수행 전 참조독성물질시 험(Reference toxicant test)을 통하여 생물의 민감도가 시험에 적합함을 확인 후 이용하였다.

2.2.1.식물플랑크톤 성장저해시험

규조류, Skeletonema costatum은 해양생태계의 기초생산자 로서 국제표준시험규격(ISO 10253, 2006)에 명시되어 있는 시험 종이다. 시험에 이용된 S. costatum은 미국의 UTEX (University of Texas at Austin, USA)에서 분양받은 것을 지속 적으로 계대배양 하였고, 지수성장기의 S. costatum을 시험에 이용하기 위해 시험시작 3일 전에 본 시험과 동일한 조건에 서 전배양(pre-culture)을 실시하였다. f/2 배지(Sigma-Aldrich)를 첨가한 시험용액을 농도별로 제조한 후 100 mL씩 250 mL 삼 각플라스크에 분주하였으며 대조구와 실험구는 모두 지수 식으로 4 반복구를 두었다. 초기 접종밀도는 5,000 cells/mL가 되도록 하였으며, 진탕배양기(DS-SI220R, Dongseo Science Co., Ltd., Korea)를 이용하여 20±2°C, 6,000~10,000 lux 조도의 연 속조명하에서 72시간 동안 배양하였다.

2.2.2.무척추동물 독성시험

윤충류, Brachionus plicatilis(로티퍼)는 전 세계적으로 분포 하는 해양생태계내의 1차 소비자로서, 국제표준시험규격 (ASTM E1440-91, 2012)의 표준 시험종으로 제시되어 있다. 본 시험에 이용된 로티퍼의 휴면포자는 MicroBioTests Inc. (Belgium)에서 공급 받았으며 부화 후, 건강한 개체를 선별하 여 시험에 이용하였다. 모든 대조구 및 실험구는 지수식으로 5 반복구를 두었으며, 각각 10개체의 유생을 micropipet을 이 용하여 투입하였고 인큐베이터(JSCC-150, JSR Co., Ltd., Korea) 를 이용하여 25±1°C, 연속 암기조건 하에서 24시간(급성독성 시험) 및 96시간(만성독성시험) 동안 배양하였다.

2.2.3.어류 독성시험

어류, Cyprinodon variegatus(양두모치)는 해양생태계 내의 포식자로서, 국제표준시험규격(EPA-821-R-02-014, 2002)의 표 준 시험종으로 제시되어있다. 양두모치의 성체는 Aquatic Research Organisms (USA)에서 분양 받았으며, 수정 후 24시간 이내의 수정란을 시험에 이용하였다. 대조구와 실험구는 모 두 3 반복구를 두었으며, 급·만성 모두 500 mL의 시험용액 에 각각 10개체의 수정란을 투입하였고 반지수식으로 25± 1°C, 550~1,000 lux의 조도로 명암주기 16:8 하에, 용존산소 농도가 4.0 mg/L 이상으로 유지되도록 96시간(급성독성시험) 및 9일(만성독성시험) 동안 배양하였다. 환수는 매 각각 48 시간(급성) 및 24시간(만성)마다 시험용액의 80 %를 실시하 였다.

2.2.4.퇴적물 독성시험

발광박테리아, Vibrio fischeri는 해양생태계 거의 모든 영역 에서 관찰되며 특히 저서환경 또는 심해에 많이 분포하는 것으 로 알려져 있다(Lee et al., 2006). 저서성 단각류, Monocorphium acherusicum는 우리나라를 비롯하여 전 세계 해양에 널리 서 식하는 저서생물 중 한 종으로 이 두 종은 국내 해양환경공 정시험기준의 퇴적물 독성시험의 표준 시험종으로 제시되 어있다. 시험에 이용된 생물은 모두 NeoEnBiz Co. Ltd.(Korea) 에서 공급 받았으며 발광박테리아 독성시험의 경우 건조된 발광박테리아를 활성화시켜 N-tox^® (NeoEnBiz Co. Ltd., Korea) 측정기기를 이용하여 30분간 발광도를 측정하였다.

저서성단각류 독성시험의 경우, 300~500 μm의 어린 개체 를 이용하였고 대조구와 실험구는 모두 4 반복구로 두었으 며 반지수식으로 20±1°C, 550~1,000 lux의 조도로 명암주기 16:8 하에, 용존산소 농도가 4.0 mg/L 이상으로 유지되도록 4 일간 배양하였다.

2.2.5.통계 분석

NOEC(no observed effect concentration)와 LOEC(lowest observed effect concentration)의 산출을 위해서 S. costatum의 성장률, B. plicatilis의 생존율 및 개체군 성장률, C. variegatus의 생존율, V. fischeri의 발광율 및 M. acherusicum의 생존율의 결과를 이 용하였다. 대조구와 실험구들 사이에 유의한 차이의 유무를 확인하기 위하여 ANOVA(analysis of variance)를 이용하였고 대조구와 유의한 차이가 나타나는 실험구 중 가장 낮은 농 도를 LOEC, 차이가 나타나지 않는 가장 높은 농도를 NOEC 로 나타내었다. ANOVA를 수행하기 위한 정규분포(normal distribution)의 검증은 Shapiro Wilk's test와 Komolgorov D test를 이용하였고 Bartlett's test로 자료의 동질성(homogeneity)을 검 증하여 Dunnett's test를 이용한 유의수준 α=0.05에서 분석하 였다. 정규분포를 따르지 않거나 동질성을 보이지 않는 경 우 비모수 검정으로 Steel's many-one rank test를 이용하여 분 석하였다. LC50(50 % lethal concentration) 및 EC50 (50 % effect concentration)은 선형보간법(linear interporation)을 이용하여 산 출하였다. 모든 생물독성시험의 결과값에 대한 통계분석은 TOXCALC 5.0 program(Tidepool scientific software, USA)를 이 용하였다.

3.결과 및 고찰

3.1.시험의 유효성

본 시험 수행 전 참조독성물질시험(Reference toxicant test) 을 수행한 결과, 모든 생물의 민감도가 시험규격에서 제시 하는 범위 내에 들어오는 것을 확인하였다(Table 2). 또한, 모 든 생물독성시험은 항온항습 시스템 하에서 수행되었으며 시험기간 동안 각 시험규격에서 제시하는 환경조건(온도 범 위, pH 변화 및 광조건 등)과 시험의 유효성을 판단하는 시 험의 유효기준을 모두 만족하였다(Table 3).

3.2.pH 변화에 따른 독성시험

HNO₃를 이용한 pH 변화에 대한 독성시험 결과, 식물플랑 크톤 성장저해시험을 제외한 모든 시험에서 시험기간 동안 pH의 변화는 초기에 설정한 값의 0.16±0.07로 유지되었지만 식물플랑크톤의 경우, 초기 pH 6의 실험구는 시험종료 시점 에 8.8까지 상승하였으며 초기 pH 5의 실험구는 7.1까지 상 승하였다. 이는 식물플랑크톤의 광합성 작용으로 인해 시험 용액의 CO₂를 감소시켜 pH가 증가하는 현상이 나타난 것으 로 판단된다(Lee et al., 2006). 저서성단각류, M. acherusicum이 NOEC, LOEC 및 72h-EC₅₀ 값이 각각 pH 7(0.3 mM, HNO₃) 6(1.1 mM) 및 pH 5.2(1.4 mM)로 가장 민감한 종으로 나타났다 (Table 4). 다음으로 해양 생태계의 가장 낮은 영양단계인 식 물플랑크톤이 pH에 민감한 영향을 보였으며 식물플랑크톤 을 제외한 무척추동물, 어류 및 발광박테리아의 급·만성 독성시험 결과, 모두 pH 5 까지 독성영향을 보이지 않았다. 발광박테리아의 경우, Lee et al.(2006)의 pH 변화 독성실험의 결과, EC₅₀ 값이 pH 4.6~5.2로 나타나 본 연구에 비해 pH 변 화에 더욱 민감하게 반응하는 것으로 나타났다. 또한 저서 성단각류의 경우, EC₅₀ 값이 평균 pH 6.2로 발광박테리아에 비해 상대적으로 민감한 것으로 나타났으며 본 연구에서도 발광박테리아를 포함한 모든 시험생물 중 가장 민감한 영향 을 나타냈다. 이 밖에도 해수의 인위적인 pH 감소에 따른 생 물학적 연구에 대해서는 오래전부터 연구가 진행되어 왔다. 식물플랑크톤의 경우, 실험초기의 pH가 6.0~7.0 범위일 때 광 합성 및 성장저해가 일어난다는 연구결과가 있으며(Knutzen, 1981) 이매패류인 Pinctata fuscala의 경우 초기 pH가 7.4~7.7 이하일 때 성장 및 생존에 독성영향을 나타낸다는 보고가 있다(Kuwatani and Nishii, 1969). pH에 대한 생물의 영향 정도 는 생물종 또는 개체간의 회복능력에 따라 크게 달라 질 수 있으며 일부 민감종의 경우 상당히 적은 pH 변화에 의해서 도 독성영향이 나타날 수 있다(Knutzen, 1981).

그러나 일반적으로 자연해수(약 35 PSU)의 pH 범위는 7.8~8.2 가 대부분이며 호기성 환경의 해수 pH가 7.6 이하로 내려가 는 경우는 드물다(Knutzen, 1981). 질산 유출사고로 인하여 일 시적으로 사고 선박주변의 pH가 감소하더라도 해수의 pH 완충능력과 확산에 의한 희석으로 pH는 짧은 시간 내에 정 상적인 범위로 회복될 수 있으며 수서생물의 경우 세포내에 pH를 일정하게 유지할 수 있는 능력이 있으므로 산성화된 환경에 노출된다 하더라도 일정시간이 지나면 회복될 수 있 다(Pörtner et al., 1998). 또한 질산은 기존의 다양한 환경위해 성평가(Environmental Risk Assessment)방법 중 물질의 정성적 특성 나타내는 지표인 PBT(P ; persistency, B ; bioaccumulation, T ; toxicity)특성을 고려하였을 때, 지속성을 나타내는 수중 에서의 반감기(half-life)가 30일로 기준이 되는 60일 초과하지 않아 지속성을 보이지 않았으며 생물 축적성을 나타내는 BCF(bioaccumulation factor)가 3.162 L/kg wet-wt로 기준이 되는 2,000 L/kg wet-wt를 초과하지 않아 생물 축적성을 보이지 않 았다(EPI suite^TM, USEPA). 또한 생물독성을 나타내는 만성독 성시험에서의 NOEC가 0.107 mg/L(Daphnia magna, ECOTOX) 로 0.01 mg/L 이하로 검출되지 않아 독성을 보이지 않았다. 따라서 질산이 유출된 후 pH 변화에 의한 해양생물의 독성 영향은 사고 선박 최단 인접 해역을 제외하면 지속성, 생물 축적성등을 고려할 때 극히 미미할 것으로 생각된다.

3.3.NO3- 변화에 따른 독성시험

NO₃^-에 대한 독성시험의 결과, B. plicatilis의 만성독성시험 (개체군 성장률시험)에서 NOEC, LOEC 및 96h-EC₅₀ 값이 각 각 5.9 mM, 11.8 mM 및 32.6 mM로 가장 민감한 영향이 나타 났다(Table 5). 시험 종말점을 생존률로 판단하는 B. plicatilis 의 급성독성시험 결과와 비교하였을 때 민감도는 약 10배 가 량 차이가 나는 것으로 나타났다. Buhl et al.(1993)과 Villarroel et al.(1999)은 무척추동물인 Daphnia magna의 만성독성시험의 번식능력이 생존능력보다 더 민감한 종말점이라고 보고하 였으며, 본 연구 결과에서도 종은 상이하지만 비슷한 결과 를 보였다. 종 증식률은 첫 번째 새끼를 낳는 시기, 산자수 의 영향을 받기 때문에 이 두 변수가 변하게 되면 종 증식률 역시 민감하게 변하게 된다(Stearns, 1976).

그러나 S. costatum을 이용한 식물플랑크톤 성장저해시험 결과, pH 시험결과와 상이하게 독성영향이 발광박테리아를 제외한 모든 생물에 비해 가장 작게 나타났으며 이는 식물 플랑크톤의 광합성 및 성장에 있어 질산염을 영양염으로 소 비하기 때문에(Lee et al., 2013) 높은 농도의 질산염에도 강한 내성을 보이는 것으로 추정된다.

이 밖에 어류 및 무척추동물의 경우 이전 연구결과와 비 교해본 결과, 무척추동물, D. magna의 번식력을 종말점으로 설정한 만성독성시험에서 LOEC 값이 0.17~8.44 mM로 본 연 구결과와 비슷한 결과를 보였으며 (Scott and Crunkilton, 2000) 생존률을 종말점으로 설정한 급성독성시험의 경우 D. magna 와 Lepomis macrochirus의 LC₅₀값이 각각 70.4와 150.6 mM로 번식력에 비해 상대적으로 민감도가 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다(Dowden and Bennett, 1965).

그러나 일반적으로 자연해수의 질산염 농도는 10 μM 미만 으로 존재하며 한양 에이스호 사고가 일어난 울산 및 온산 연 안의 사고이전 2010년부터 2014년까지 5년의 평균 질산염 농도 는 1.87 μM 였다(국가해양환경정보통합시스템; www.meis.go.kr). 또한 2007년 이스턴브라이트호의 질산 화물선 침몰사고에서 사고 후 질산 이적 작업으로 인한 유출에 대하여 해양환경 조사가 이루어졌으며 질산염을 포함한 DIN(용존무기질소)의 경우 사고 및 이적작업 후 1.63~12.86 μM로 나타나 질산염의 농도가 높아졌다고 판단할 수 없었다(Kim et al., 2014). 그러 나 실제 질산 유출 사고시, 주변 해역의 질산염의 농도는 실 제 질산의 유출량, 사고해역의 환경(수심, 해류)등 많은 변수 에 의해 조절되므로 본 연구 단계에서 영향의 유무를 판단 하기에 어려움이 존재하지만 질산 유출사고가 일어난 후 질 산에서 해리된 질산염이 사고해역에 확산되어 증가하더라 도 실제 생물의 생존 및 번식능력에 미치는 영향농도까지 도달하기에는 현실적으로 불가능할 것으로 생각된다.

4.결 론

질산의 유출사고로 인한 pH 변화 및 질산염 농도에 따른 해양생물 독성시험 결과를 종합하면, pH 변화에 대해서는 저서성단각류가 EC₅₀값이 pH 5.2로 가장 민감한 영향을 보였 으며 다음으로 가장 낮은 영양단계인 식물플랑크톤이 민감 한 영향을 보였다. 하지만 본 시험결과와 이전 연구결과를 바탕으로 질산 유출사고로 인하여 일시적으로 해역의 pH가 감소하더라도 해수의 pH 완충능력, 확산에 의한 희석과 수 서생물의 회복 능력 등을 고려하였을 때 pH변화에 의한 해 양생물의 독성영향은 선박의 최단 인접지역을 제외하면 그 영향은 극히 미미할 것으로 판단된다. 또한 질산염의 경우, 무척추동물인 B. plicatilis의 만성독성(개체군 성장률)시험에 서 LOEC 값이 11.8 mM로 가장 민감한 영향을 보였으며 식 물플랑크톤은 발광박테리아를 제외한 모든 시험생물 중 가 장 큰 내성을 보였다. 본 시험결과와 이전 연구결과를 종합 하였을 때 생물의 생존 및 번식에 직접적으로 영향을 미칠 수 있는 질산염 농도는 질산 유출사고가 발생하더라도 현실 적으로 존재 할 수 없는 농도로 판단된다. 그러나 이러한 질 산 유출사고가 일반적으로 해류의 유동이 존재하는 해역이 아닌 반 폐쇄성 만 등과 같은 좁은 해역에서 발생할 경우 그 영향은 상당할 것으로 예상되며 이에 대한 추가적인 해수의 유동 및 확산 모델과 같은 물리화학적 연구가 필요할 것으 로 생각된다.

본 연구에서 HNS 유출사고 대응 체제의 구축의 일환으로 수행한 HNS에 대한 해양생물독성시험은 실제 생물을 이용 하여 정량적인 독성영향을 파악할 수 있다는 이점이 있으며 사고 해역의 이화학적 모니터링에 국한된 현재의 대응시스 템을 보완할 수 있는 하나의 대안으로 생각된다. 또한 이러 한 생물독성시험법은 다양한 사고유형 및 HNS의 종류에 따 라 적절한 세부시험절차가 마련되어야 할 것이며 시험결과 를 바탕으로 주요 HNS 해양생물독성 정보구축 및 나아가서 는 환경위해성평가의 지표로도 활용할 수 있을 것으로 사료 된다.