1.서 론

미세조류는 태양에너지를 이용하여 무기물을 유기물로 합 성하는 광합성 작용을 하며, 부산물로 산소를 방출한다. 이 처럼 미세조류는 광합성을 기반으로 하는 생명체이므로 무 엇보다도 광 관련 인자 즉, 빛의 파장 및 광량은 매우 중요 한 요소로 인식되고 있다. 특히, 빛의 파장은 광합성 색소의 조성, 광합성 속도, 세포 내 생화학적 조성, 성장속도, 이온 수송, 영양염 흡수속도, 세포외 배출, 효소활성에 관여하는 등 미세조류의 생리적인 측면을 조절하는 것으로 보고되었 다(Wallen and Geen, 1971; Vesk and Jeffrey, 1977; Grotjohann et al., 1991; Schimid and Dring, 1996; Sάnchez-Saavedra and Voltolina, 1996; Oh et al., 2008; Kwon et al., 2013). 그 예로 Sάnchez-Saavedra and Voltolina(1996)에 의하면 청색파장에서 성장한 미세조류는 동일한 광량의 형광램프에서 성장한 미 세조류보다 더 많은 아미노산과 단백질을 세포 내에 함유 하며, 그 함유량은 광량이 증가함에 따라 증가하는 것으로 보고하였다.

미세조류를 배양함에 있어 광원의 선택은 가장 중요한 요소이며, 이전까지는 광원으로 주로 태양광, 형광등, 할로 겐 금속 램프와 같은 전체 스펙트럼의 인공광원이 사용되 고 있지만 최근 발광다이오드(Light Emitting Diode; LED)가 급속도로 발달함에 따라 이러한 광원들을 LED로 대체하려 는 시도가 많이 이루어지고 있다. LED는 양과 음의 성질을 띠는 두 개의 화합물을 접합하여 전기가 흐르면 빛이 발생 하는 원리를 이용한 것으로 접합하는 화합물의 종류에 따 라 빛의 파장이 달라져 이론적으로는 모든 파장대의 빛을 구현해 낼 수 있다. 특히, LED는 식물의 광합성 및 성장에 필요한 파장역을 단일 또는 혼합하여 임의로 조절이 가능 하며, 빛 조사시간 동안 분 단위 또는 초 단위의 간헐적인 광 제어가 가능하다. 이러한 장점을 바탕으로 LED는 육상 식물의 육성을 위한 인공광원으로 활발히 이용되고 있으 며, 최근에는 미세조류의 배양 효율을 극대화시키기 위한 광 원으로도 주목받고 있다(Wang et al., 2007; Xue et al., 2011; Fu et al., 2013).

한편, 미세조류는 이산화탄소를 제거하고 산업적으로 유 용한 다양한 이차 대사물질을 생산해 내는 광합성 미생물 로 생물산업 분야에서 주목 받고 있는 유용한 자원이다. 특히, LED의 특정 광도, 파장 및 pulse 등을 배양 단계에 맞 게 적절하게 조사해서 미세조류를 배양하여, 광합성 색소와 항 산화물질, 지질과 같은 유용 생리활성물질의 합성이 촉 진될 수 있음이 최근 연구되어 지고 있다(Katsuda et al., 2004; Menon et al., 2013; Xu et al., 2013). Katsuda et al.(2004) 에 의하면 녹조류 Haematococcus pluvialis의 경우 청색 LED 하에서 배양 시 astaxanthin의 생산효율이 증가하였다. 또한 세포 내 지질 함량이 높아 바이오디젤로 사용하기 우수한 종으로 알려진 녹조류 Botryococcus braunii의 경우 적색, 청 색 그리고 녹색 LED에 따라서 세포 내 지질 및 탄수화물 의 함량에 변화를 줄 수 있음이 확인되었으며(Baba et al., 2012), 녹조류 Dunaliella salina의 경우 적색 LED를 이용하여 배양하면 β-carotene의 함량을 증진시킬 수 있음을 확인하였 다(Fu et al., 2013). 이렇듯 LED를 이용하면 미세조류의 유 용물질의 함량을 증진시킬 수 있는 긍정적인 연구 결과들 이 보고되고 있다.

또한 미세조류는 광합성을 할 때 이산화탄소를 소모하 고, 증식을 위해서 질소, 인 및 미량금속을 사용하게 되는 데, 이러한 원리를 이용하여 최근에 다양한 환경오염 문제를 해결하기 위해서 다각적인 연구가 진행되고 있으며, 미세조류 를 이용한 폐수처리, 중금속 흡착, 이산화탄소의 고정화 등 미 세조류의 환경정화 능력이 주목받고 있다. 녹조류 Chlorella vulgaris의 경우 LED 파장에 따라 질소와 탄소 같은 영양소 의 제거효율이 다른 것으로 나타났으며, 녹조류 Scenedesmus sp.는 LED 단일파장의 조건에서 보다 청색과 적색 LED 혼합 조건에서 질소와 인의 제거효과가 높은 것으로 보고하였다 (Kim et al., 2013; Yan et al., 2013). 뿐만 아니라 Kwon(2013) 은 LED를 이용하여 미세조류의 성장을 촉진시킴으로써 부 영양화된 퇴적물의 생물학적 제거가능성을 파악하였으며, 그 결과 미세조류의 성장촉진은 질소, 인 및 황화수소의 저감에 효과적인 것으로 보고하였다. 특히, 다수의 연구에 서 미세조류는 중금속의 흡수 및 흡착 기작을 통해서 제거 가능한 것으로 알려져 있기에(Arkipo et al., 2004; Gupta and Rastogi, 2008; Monteiro et al., 2011), Kwon(2013)은 질소, 인, 황화수소 이외의 미세조류 성장 촉진에 따라 퇴적물 중 중 금속의 생물학적 제거 가능성을 언급하였다. 따라서 본 연구 는 비교적 중금속의 높은 흡착을 보이는 것으로 알려진 녹조 류 Chlorella vulgaris, 규조류 Phaeodactylum tricornutum(Torres et al., 1998; Fraile et al., 2005) 그리고 퇴적물의 고농도의 독 성물질(암모니아, 황화수소, 중금속 등)에 대한 내성이 높은 것으로 알려진 규조류 Skeletonema costatum 및 저서성 미세 조류 Nitzschia sp.(Metaxas and Lewis, 1991; Kwon, 2013)의 LED 파장과 광량에 따른 미세조류의 광학적 특성을 파악하 며, LED와 미세조류를 이용한 오염퇴적물 중 중금속의 생물 학적 제거 가능성 파악을 위한 기초자료로 활용하고자 한다.

2.재료 및 방법

2.1.미세조류 4종의 확보 및 유지배양

실험에 이용된 규조류 Phaeodactylum tricornutum(KMMCC -309)과 녹조류 Chlorella vulgaris(KMMCC-190)는 한국해양미 세조류은행(Korea Marine Microalgae Culture Center, Korea)에 서 분양받아 이용하였다. 또한 규조류 Skeletonema sp.는 2013년 4월 자란만 표층해수, 저서성 규조류 Nitzschia sp.는 2010년 4월 수정만 표층 퇴적물로부터 pasteur pipette(Φ 50~100 μm)을 이용하여 순수 분리하였다. 분리된 세포는 여 과해수(0.22 μm pore size, Millipore GSWP)를 이용하여 3~4회 반복 세척하여 배양튜브(TB-2800, Tokyo, Japan)에 이식하였 다. 사용된 배지는 동해 외양수를 바탕으로 한 f/2 배지로, selenium(Na₂SeO₃)의 최종농도가 0.001 μM이 되도록 첨가하였 다(Guillard and Ryther, 1962). 유지배양의 온도와 염분은 각 각 20 ℃, 30 psu였으며, 광량은 약 100 μmol/m²/s(12L:12D, cool -white fluorescent lamp)로 조절하였다. 2차적인 생물학적 오 염을 막기 위해서 모든 실험기구는 고압(202 kPa, 30 min) 및 건조멸균(185 ℃, 1 hr) 후 사용하였으며, 모든 작업은 무균 대에서 수행하였다.

2.2.파장에 따른 미세조류 4종의 성장속도 변화

파장에 따른 세포밀도의 증감은 현미경을 이용한 직접 검경이 아닌 in vivo chlorophyll 형광값을 활용하였다. 이는 형광광도계에서 직접 측정이 가능한 배양튜브를 이용하기 에 세포밀도의 확인을 위한 배양튜브의 개폐가 없어 초기 배양상태를 계속 유지 할 수 있으며, 대량의 표본을 신속 히 처리 할 수 있는 장점이 있다(Brand et al., 1981). 세포밀 도와 in vivo chlorophyll 형광값 사이의 관계를 파악하기 위 해 각각의 미세조류를 유지배양과 동일한 조건(20℃, 30 psu, 100 μmol/m²/s)에서 대수성장기(exponential growth phase) 까지 배양한 후, 여러 단계의 세포밀도로 조제하였다. 조제 된 세포밀도를 형광광도계(10-AU-005, Turner Designs, USA) 를 이용하여 in vivo chlorophyll 형광 값을 측정하였다. 그 결과 세포밀도와 형광값 사이에는 통계적으로 매우 높은 유의성이 확인되었다(Table 1).

파장별 광량에 따른 성장실험을 위한 광원은 복수파장으 로 형광램프(fluorescent lamp)를 이용하였으며, 단일파장은 청색 LED(450 nm), 황색 LED(590 nm) 그리고 적색 LED(650 nm)를 이용하였다. 각각의 미세조류를 수온 20℃, 염분 30 psu, 광량 100 μmol/m²/s의 조건에서 대수증식기 후기까지 성장시킨 후 9 mL 배양튜브(10☓100 mm)에 f/2 배지 5 mL를 주입하여, 최 종 세포밀도가 약 1.0☓10² cells/mL이 되도록 접종하였다. 광원 별 광량은 가시광선 차단필름을 이용하여 10, 30, 50, 70, 100, 150, 300 μmol/m²/s(QSL-2100, Biospherical Instrument Inc., San Diego CA, USA)의 7단계로 조절하였다. 이후 이틀간격으로 오전 10시에 형광광도계로 형광량을 측정하였다. 성장속도 는 대수성장을 보이는 기간 동안의 세포밀도를 이용하여 아래의 식(1)에 대입하여 계산하였다. 모든 실험은 3회 반 복으로 수행하였으며, 성장속도는 명백한 오류로 판명된 값을 제외하여 평균하였다.

μ: 성장속도(specific growth rate; /day)

N₀, N_t: 대수성장기에서 초기와 t시간(day) 후의 세포밀도 (cells/mL)

△t: 대수성장기의 기간(day)

성장속도와 광량의 관계는 Lederman and Tett(1981)의 모 델을 개량한 다음 식(2)를 이용하여 계산하였다.

μ: 성장속도(specific growth rate; /day)

μ_max: 최대성장속도(maximum specific growth rate; /day)

I: 광량(irradiance; μmol/m²/s)

I₀: 보상광량(compensation PFD; μmol/m²/s)

K_s: 반포화광량(half-saturation light intensity; μmol/m²/s)

3.결과 및 고찰

3.1.단일파장에 따른 미세조류 4종의 성장 특성

4종의 미세조류는 파장별 광량이 증가함에 따라 세포밀도가 증가하였으며, 일정 광량 이상의 조건에서는 세포밀도가 일정 하였다(Figs. 1, 2, 3, 4). 최대세포밀도의 경우 P. tricornutum, Nitzschia sp. 그리고 Skeletonema sp.는 청색 LED에서 각각 5.88×10⁶ cells/mL, 1.52×10⁶ cells/mL, 3.25×10⁶ cells/mL로 가장 높았으며, 형광램프, 적색 LED, 황색 LED 순으로 낮았다 (Figs. 1, 2, 3). 반면에 C. vulgaris는 적색 LED 조건에서 8.75×10⁶ cells/mL로 가장 높은 최대세포밀도를 보였으며, 청 색 LED, 형광램프, 황색 LED 순으로 낮았다(Fig. 4).

미세조류 4종의 성장속도의 경우 파장별 광량이 증가함에 따라 성장속도가 증가하였으며, 일정 광량 이상에서는 일정하 였다(Fig. 5). P. tricornutum, Nitzschiam sp. 그리고 Skeletonema sp.의 최대성장속도(μ_max)는 청색 LED에서 각각 1.34 /day, 0.94 /day, 1.90 /day의 가장 높았으며, 형광램프, 적색 LED, 황색 LED 순으로 낮았다. C. vulgaris 역시 적색 LED 하에 서 1.09 /day로 가장 높게 나타났으며, 청색 LED, 형광램프, 황색 LED 순으로 낮았다. 보상광량(I₀)은 4종 모두 모든 파 장조건에서 10 μmol/m²/s 이하의 값을 보였다.

단일파장 중 P. tricornutum, Nitzschia sp. 그리고 Skeletonema sp.는 청색파장에서 가장 높은 최대세포밀도와 빠른 성장속 도를 보였다. 주요한 광합성 색소인 chlorophyll a는 주로 보 라-청색 파장대와 적색파장대의 빛을 흡수하며 특히, 청색 파장은 미세조류의 성장이나 광합성에 효과적으로 이용되 는 파장대이고, 광수용기를 통해 미세조류의 유전자 발현 및 물질의 신진대사에 영향을 주는 것으로 알려져 있다 (Kianianmomeni and Hallmann, 2014). 미세조류의 청색파장에 서 높은 성장속도는 본 연구 뿐만 아니라 다수의 연구에서 밝혀졌다. 규조류 Chaetoceros sp., Thalassiosira minima, 와편 모조류 Cochlodinium polykrikoides, Heterocapsa circularisquama, Prorocentrum minimum, P. triestimum, P. dentatum, 침편모조류 Heterosigma akashiwo는 다른 파장에 비해서 청색파장에서 뚜렷한 성장촉진의 효과가 나타났다(Oh et al., 2006, 2008; Shikata et al., 2009). 뿐만 아니라 규조류 Cyclotella nana는 백색파장과 비교하여 청색파장에서 chlorophyll a가 증가하 였다(Wallen and Geen, 1971). 또한 규조류 Stephanopyxis turris 는 백색파장보다 청색파장에서 chlorophyll a, c, fucoxanthin, carotenoids 등의 색소가 증가되었으며(Jeffrey and Vesk, 1977), 청색파장에서 성장한 미세조류는 동일한 광량의 형광램프 에서 성장한 미세조류보다 더 많은 아미노산과 단백질을 세포 내에 함유하는 것으로 보고되었다(Sάnchez-Saavedra and Voltolina, 1996). 이처럼 청색파장에서 성장촉진과 광합성 색소의 증가는 청색파장에서 tricarboxilic acid 합성, DNA와 RNA 합성의 촉진이 주요한 요인으로 제시되었다(Wallen and Geen, 1971; Gostan et al., 1986). 따라서 본 연구의 P. tricornutum, Nitzschia sp. 그리고 Skeletonema sp.의 경우 청색 파장에서 높은 성장속도는 DNA 합성의 촉진에 따른 세포 분열의 가속에 의한 결과로 생각된다.

적색파장의 경우 본 연구의 C. vulgaris와 유사하게 일부 미세조류에서 성장을 위한 최적의 파장으로 보고되었다. 이들 결과에 의하면 남조류 Spirulina platensis, Synechococcus sp. 그리고 녹조류 Chlorella pyrenoidosas와 Haematococcus pluvialis의 경우 적색파장에서 높은 성장속도 및 최대세포 밀도를 보였다(Takano et al., 1995; Matthijs et al., 1996; Jeon et al., 2005; Wang et al., 2007). 녹조류와 남조류는 주 색소 인 chlorophyll a 이외에 보조색소(accessory pigment)로서 각 각 chlorophyll b와 allophycocyanin을 세포내에 함유하고 있 다. 특히, chlorophyll b는 660 nm 그리고 allophycocyanin은 650 nm의 적색파장을 흡수하여 chlorophyll a로 광 에너지를 전달하게 된다. 이처럼 적색파장을 효율적으로 흡수 할 수 있는 보조색소의 보유에 따라 적색파장을 성장에 효율적으 로 이용할 수 있는 것으로 보인다. 이에, 적색 LED를 이용 하여 Dunaliella salina를 배양하면 β-carotene의 함량을 증진 시킬 수 있음을 확인하였다(Fu et al., 2013). 따라서 미세조 류의 성장을 위한 최적파장은 녹조류와 남조류에 특징적으 로 나타나는 분류군 특이성(taxon-specific)을 보이는 것으로 판단된다.

황색파장은 chlorophyll의 주요한 흡수 파장대가 아니지 만, 보조색소에 의해 흡수되어 일부 미세조류의 광합성에 이용되는 것으로 알려져 있다. 본 연구의 미세조류 4종은 비록 다른 파장대에 비해서 성장속도 및 최대세포밀도는 낮았지만 성장을 위한 파장대로 이용되었다. 뿐만 아니라 규조류 Chaetoceros sp., T. minima, 남조류 S. platensis에서 성 장을 위한 파장대로 보고되었다(Wang et al., 2007; Shikata et al., 2009). 하지만 유해 와편모조류 Alexandrium tamarense, C. polykrikoides, H. circularisquama는 일정 광량 이하의 황색파 장에서 성장이 억제 되었다(Oh et al., 2006, 2008; Kwon et al., 2013). 또한 규조류 Cyclotella cryptica의 경우도 다른 파 장대에 비해 황색파장은 성장속도와 세포밀도는 낮은 반면 에 지질의 생산은 촉진되는 것으로 나타났다(Shih et al., 2014). 따라서 황색파장은 규조류, 남조류, 녹조류 등에서는 성장을 위한 파장대이나 편모조류의 경우에서 성장 억제력 이 있는 것으로 판단된다. 뿐만 아니라 황색파장은 미세조 류의 성장 촉진 및 세포밀도의 증가 효과는 없지만, 유해 조류의 성장억제와 바이오연료(biofuel) 생산 등 목적에 따 라서 유용한 파장이 될 수 있을 것이다.

한편, 미세조류 연구 및 상업적인 목적을 위해 이용되는 인공적인 광원으로 대개 태양의 스펙트럼과 유사한 형광램 프와 같은 전체 스펙트럼의 광원이 사용되고 있다. 본 연 구에 이용된 미세조류 4종도 형광램프의 경우 단일 파장의 청색 혹은 적색파장보다 최대성장속도 및 세포밀도는 낮았 지만 비교적 유용한 광원이었다. 하지만 미세조류가 함유 하고 있는 광합성 색소에 따라 다양한 범위의 파장대를 흡 수 할 수 있는데, 형광램프의 경우 가시광선대의 모든 파 장을 구현하지 못하기 때문에, 일부 미세조류의 광합성 활 성이 낮아지기도 한다(Carvalho et al., 2011). 특정종의 경우 LED 파장에 따라 세포 내 지질 및 탄수화물의 함량에 변 화를 줄 수 있어 인위적인 광조절의 결과로 많은 양의 바 이오디젤을 확보 할 수도 있다(Baba et al., 2012). 또한, 파 장 및 pulse 등의 조절에 따라 Haematococcus pluvialis의 astaxanthin의 생산이 증대되기도 한다(Katsuda et al., 2004). 따라서 미세조류는 파장에 따른 성장특성이 종 혹은 분류 군에 대한 특이성을 보이기 때문에 가시광선대의 전반적인 파장을 가지지 못하는 형광램프 보다는 단일파장을 활용하 면 미세조류를 활용한 바이오산업의 활용 측면에서 더 효 과적이라고 판단된다.

3.2.중금속의 생물학적 제거를 위한 LED와 미세조류의 활용

산업발달과 인간 활동에 의한 다양한 형태의 중금속들은 최종적으로 연안 수계 및 해저 퇴적물로 유입되어 양적·질 적으로 오염을 가증시키고 있다. 특히 연안퇴적물에 있어 서 중금속의 오염은 해양 생산물, 퇴적물의 질, 저서생태계 에 악영향을 주고 있을 뿐만 아니라 인간에게도 잠재적인 위험을 줄 가능성이 부각되고 있다. 이런 이유로, 중금속으 로 오염된 퇴적물의 정화를 위한 기술개발은 매우 중요하 게 판단되고 있지만, 현재 우리나라는 오염퇴적물에 대한 적절한 관리 및 처리방법이 부족한 실정이다.

미세조류는 성장을 위해서 질소, 인과 같은 다량 영양염 이외에 Fe, Cu, Zn, Ni, Co, Mg, Mn 등과 같은 미량 금속 성 분이 필요하며, 금속 성분은 세포 내에서 촉매로서 작용하거 나 구조적인 역할, 생지화학적 기작을 활성화 시킨다(Butler, 1998). 특히, 최근에는 일부 미세조류의 Cr, Cd, Hg, Pb, As 등 의 중금속에 대한 높은 제거 능력이 밝혀지면서 미세조류를 중금속 제거에 활용하는 연구가 활발히 진행되고 있다(Arkipo et al., 2004; Gupta and Rastogi, 2008; Monteiro et al., 2011).

한편, 식물환경복원(phytoremediation)은 오염물질을 분해 하거나 제거하는데 식물의 능력을 이용하는 친환경적인 환 경복원기법이다. Kwon(2013)은 LED와 미세조류를 이용하여 부영양화된 퇴적물의 친환경적인 복원가능을 제시한 바 있 다. Kwon(2013)의 연구에 의하면 LED 파장에 따른 미세조 류의 성장 촉진은 광합성 속도뿐만 아니라 영양염 흡수 속 도에 까지 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이러한 미세조 류의 생리특성을 바탕으로 LED를 이용하여 미세조류의 성 장을 촉진시킴으로써 부영양화 퇴적물의 황화수소, 질소 및 인이 제거되어, LED와 미세조류를 이용한 식물환경복원 기법은 오염퇴적물을 복원하기 위한 친환경적인 복원 기법 으로 제시하였다. 특히, LED 파장에 따른 미세조류의 성장 촉진은 퇴적물 중 황화수소, 질소, 인 이외에 흡수 및 흡착 기작을 바탕으로 중금속을 제거 할 수 있을 것으로 제안 하였다. 하지만 이를 위해서는 본 연구의 미세조류의 파장 별 성장 특성 뿐만 아니라 중금속에 대한 성장동력학적 특 성을 파악할 필요성이 있다. 또한 LED 파장에 따라 미세조 류의 중금속 흡착 및 흡수 기작에 대한 파악도 필요할 것 이다. 이러한 결과를 바탕으로 미세조류의 중금속 제거 전 략을 종합적으로 평가한다면, 향후 LED와 미세조류를 활용 한 중금속 오염 퇴적물의 정화를 위한 중요한 정보로 활용 할 수 있을 것이다.

4.결 론

본 연구는 규조류 Nitzschia sp., Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema sp.와 녹조류 Chlorella vulgaris의 성장에 미치는 파장의 영향을 파악하였다. 그 결과 규조류 Nitzschia sp., P. tricornutum 그리고 Skeletonema sp.의 최대성장속도와 최대세 포밀도는 청색 LED에서 가장 높았으며, 형광램프, 적색 LED, 황색 LED 순으로 높았다. 이는 청색 LED는 다른 파장 에 비해서 규조류의 성장을 촉진시키는 작용을 하는 것으로 보인다. 하지만 녹조류 C. vulgaris의 최대성장속도와 최대세 포밀도는 적색 LED에서 가장 높았으며, 청색 LED, 형광램 프, 황색 LED 순으로 높았다. 특히, 이러한 미세조류의 파장 별 성장특이성의 차이는 광합성 주색소인 chlorophyll a이외 에 보조색소의 종류에 따른 차이로 생각되며, 종 특이성 또 는 분류군 특이성을 보이는 것으로 생각된다. 따라서 이러 한 파장별 미세조류의 성장특이성의 결과를 활용한다면, 향 후 LED와 미세조류를 활용한 중금속 오염 퇴적물의 복원을 위한 중요한 정보로 활용할 수 있을 것이다.