1.서 론

나노기술(nanotechnology)은 21세기 차세대 기술로써 주목 을 받고 있다. 나노기술에 의해 만들어진 나노물질은 빠른 확산속도와 단위 부피당 넓은 표면적, 액체 혹은 기체상에 서의 탁월한 반응성, 생물 분자와의 비슷한 크기 등의 매우 흥미로운 특징들을 가지고 있다(Hwang et al., 2007). 이에 따 라 고기능성 혹은 신기능성을 가진 초미립자에 대한 관심이 높아지면서 현재 전자제품, 기능성화장품, 반도체 등으로 개 발되어 상용화되어 있다(Lee and Suh, 2008). 특히 무기계 자

외선 차단제로 알려진 ZnO과 TiO₂나노입자는 형태제어, 투 명성 향상, 내수성 향상 등에 관해 많은 연구가 진행되어왔 다(Yang et al., 2003; Nasu and Otsubo, 2008; Iijima et al., 2007). Warheit et al.(2005)에 의하면 나노물질에 관한 최근 연 구들은 포유류 또는 세포류에 관한 잠재적 영향에 집중되어 있다고 보고 하였다. Wie et al.(2012)에서는 나노물질의 생성 과정이나 사용과정 그리고 사용 후에 오염물질 또는 폐기물 의 형태로 최종적으로 해양에 유입되어, 해양생태계에 잠재 적인 위험을 끼칠 수 있다고 보고하였다. 나노기술의 발달 과 생산으로 수중환경에 나노입자가 지속적으로 유입이 증 가될 것이지만 어떠한 형태로 생태계에 영향을 미칠지는 앞 으로 많은 연구가 필요 할 것이다.

Hund-Rinke and Simon(2006)는 TiO₂나노입자를 녹조류 (Desmodesmus subspicatus)에 노출시켜 실험한 결과 EC₅₀이 44 mgL^-1로 용량-의존적 독성이 있다고 보고하였다. 하지만 다른 실험 결과에서는 Daphnia magna에 bulk TiO₂과 nano TiO₂에 노출시켰을 때 그 영향이 서로 큰 차이를 보이지 않았 다고 하였다. 또한 Franklin et al.(2007)에서는 식물플랑크톤인 Pseudokirchneriella subcapitata에 ZnCl₂과 bulk ZnO, nano-ZnO를 노출시킨 결과 72시간 반수개체군성장률저해농도인 IC50의 값이 각각 61μg/L 과 63μg/L , 49μg/L 로 입자 크기별 영향 이 거의 없는 것으로 보고하였다. 그 이유로는 실험 과정 중 나노입자의 분산성이 안정하지 못하여 응집체로서 노출되 었기 때문이라고 보았으며 입자의 용해거동이 어떻게 응집 체에 영향을 미치는지는 정확히 알 수 없다고 보고하였다. 이와 같이 나노입자를 가지고 노출실험 한 결과에서 어떠한 영향으로 인해 유해성을 가지는지 생물에게 어떠한 영향을 미치는지에 대해 명확하게 밝혀지고 있지 않다.

이 연구에서 나노입자의 영향을 알아보기 위하여 표면 개 질과 계면활성제 투입, 초음파분쇄 등의 분산성을 높이려는 시도를 계속하였지만 실험하고자 하는 조건에서의 입자크 기를 유지하기가 어려운 상황이다. 따라서 나노입자 크기로 자연생태계에 노출되는 것보다 나노입자가 응집한 응집체 로서의 영향을 알아 볼 필요가 있다. 그리하여 이 연구에서 는 해양의 기초생산자인 식물플랑크톤을 먹이원으로 하며 해양생태계 1차소비자로 먹이연쇄를 통해 그 입자의 축적과 차후 해양환경에 노출될 확률이 높아 이에 따른 연구가 요 구되므로 국제적인 시험가이드라인을 가지고 있고 해양 생 태계의 동물플랑크톤 역할을 대체할 수 있는 물벼룩(Daphnia magna)을 이용하여 ZnO과 TiO₂나노입자의 수계(M4배지)내 응집크기를 알아보고 그 응집체가 물벼룩(Daphnia magna)에 어떠한 영향을 미치는지 유영저해(Immobilization)와 폐사율 (Death Rate)을 통해 알아보기로 한다.

2.재료 및 방법

2.1.실험 생물 및 배양

본 연구에 사용한 D.magna는 생후 8시간 이내의 신생개체 를 제공(네오엔비즈)받아 사용하였다. D.magna의 생태환경 연구용으로 주로 쓰이는 M4배지 50 ml에 5마리의 D.magna를 노출시켰으며, 4반복 실험을 행하였다. OECD 202 Daphnia sp., Acute Immobilisation Test 방법(OECD, 2004)에 준하여 한 농도 당 20개체의 성체를 사용하였으며, 실험 중에는 먹이를 공급하 지 않았다. 배지의 배양은 Incubator(NDI-100, Neo Environmental Business, Korea)에서 20±2℃의 온도로 16L:8D 간격의 광암주 기를 설정하였다.

2.2.시약 및 기구

Zinc oxide(ZnO, 20 nm, purity: 99.9 %), Titanium oxide(TiO₂, 40 nm, purity: 99.8 %)나노입자는 OECD의 WPMN(Working Party of Manufactured Nanomaterials)에서 선정한 안정성연구 물질로 (OECD, 2010), hanalintech에서 제조한 분말을 사용하였다. 두 나노입자는 Transmission electron microscope(JEM2010, Jeol, Japan)을 이용하여 분말 상태의 나노입자 크기를 측정하였 다. 그 후 Ultrasonics Processor(VCX130, sonics&materials, U.S.A) 으로 두 나노입자를 30분간 기계적 분산시키고, M4배지 (Table 1)에 첨가하였다. 이 때 M4배지 내의 나노입자가 어 느 정도의 크기로 응집이 되었는지 알아보기 위해 Zetasizer Nano(S90, Malvern, U.K)를 이용하여 입자 크기를 측정 하였다.

2.3측정 및 농도

먹이 공급을 하지 않아도 D.magna가 폐사하지 않는 최대 시간인 72시간까지 24시간 간격으로 유영저해율(Immobility)및 폐사율(Death Rate)을 측정하였다. 노출농도는 대조구(0 mg/L) 와 0.1, 10, 50, 100 mg/L로 저자가 속해있는 연구실에서 이전 에 ‘나노입자가 알테미아(Artemia sp.) cyst부화율에 미치는 영 향’(Jeong, 2009)에 관하여 9가지의 나노입자로 실험한 결과, Zn과 Ag-TiO₂나노입자에 노출된 Artemia cyst는 실험 최대 농 도인 20 mg/L에서 각각 73 %, 75 %의 부화율을 보였는데 이 를 예비실험으로 하여 생태독성 실험에서 동물플랑크톤의 경우 실제 해양환경에서 생물농축의 영향으로 고농도의 나 노입자에 노출될 위험성을 간과할 수 없고 더불어 TiO₂와 Zn의 독성차이를 고려하여 농도범위를 설정하였다. 측정방 법은 15s 동안 유영이 없는 정지된 상태를 유영저해로 보았 으며, 심장박동이 없을 때에는 폐사한 것으로 간주하여 계 수하였다.

3결과 및 고찰

3.1결과 및 고찰

나노입자를 M4배지에 노출시키기 전, 투과전자현미경 (TEM)을 이용하여 분말 상태의 나노입자 구조와 크기를 살 펴보았다(Fig. 1). ZnO나노입자의 크기는 20 nm 정도의 구형 입자들로 관찰 되었으며(Fig. 1A), TiO₂나노입자에서는 40 nm 의 정타원형 입자들로 관찰되었다(Fig. 1B).

DW와 M4배지에서의 나노입자 크기를 비교하기 위해 입 도분석기를 사용했다. 측정 결과는 Fig 2, 3에 나타내었다. DW에 분산시킨 ZnO나노입자크기는 평균 10.09 nm였으며 (Fig. 2A), TiO₂나노입자 크기는 44.65 nm로 분말상태 일 때와 비슷한 크기를 보였다(Fig. 2B). M4배지의 경우, ZnO나노입 자는 DW와 달리 708.80 nm의 크기를 보였으며 분말일 때보 다 약 70배 증가한 것으로 나타났다(Fig. 3A). 또한 TiO₂나노 입자에서도 1678 nm 크기로 DW에서보다 약 40배 증가하였 다(Fig. 2B). Sillanpäa et al.(2011)은 기수와 담수에서 TiO₂나노 입자의 응집크기 변화를 알아보았는데 담수보다 기수에서 그 응집크기가 2~5배 더 커졌다고 보고하였으며 그 원인으 로는 전기전도도가 클수록 입자 표면전위와 용액안의 이온 이 반응하여 응집한 것으로 보고하였다. 이는 우리 연구에 서 DW에서는 0.5μs/cm의 전기전도도를 가지지만 M4배지내 의 성분(Table 1)에 있어서 이온의 증가로 실제 전기전도도 가 높아져 응집의 차이를 보인 것으로 생각된다.

3.2유영저해(Immobilisation)

DW에 비해 M4배지에서 입자크기가 증가하는 것으로 나 타났는데, 이러한 변화가 해양동물에 어떠한 영향을 주는지 D.magna의 유영상태를 통해 살펴보았다. Fig. 4는 두 나노입 자를 각각의 농도별로 설정한 후 D.magna에 노출시켜 그에 따른 유영저해 실험 결과를 나타낸 것이다.

먼저 나노입자가 들어있지 않은 대조구(0mg/L)에서는 48 시간까지 아무런 영향을 보이지 않았지만, 72시간이 지나는 시점에서 약 10 % 정도의 유영저해가 있는 것으로 관찰되었 다. ZnO나노입자를 노출 시킨 D.magna는 24시간 후 10 ppm 에서 5 %, 50 ppm과 100 ppm에서는 전 개체 중의 약 30 % 정 도가 유영저해를 보인 것으로 나타났다. 48시간 경과 후에는 0.1 ppm에서 50 %의 유영저해가 나타났으며 10 ppm 이상의 농도에서는 전 개체가 유영하지 않은 것으로 나타났다. 72시 간 후에는 모든 농도에서 D.magna가 유영하고 있는 모습을 관찰 할 수가 없었다(Fig. 4A).

TiO₂나노입자의 경우 ZnO나노입자와 달리 24시간이 지나 더라도 D.magna의 유영에 영향을 주지 않는 것으로 관찰되 었다. 하지만 48시간 경과 후에는 0.1 ppm에서부터 영향을 보여 10 ppm에서 10 %, 50 ppm에서 5 %, 100 ppm에서는 20 % 의 유영저해를 보인 것으로 관찰되었다. 그리고 72시간 경과 후에는 0.1 ppm에서는 15 %, 10 ppm에서는 35 %의 유영저해 를 보였고 50 ppm에서부터는 50 %가 넘는 유영저해를 보였 다(Fig. 4B).

이와 같은 결과는 환경스트레스 또는 세포내 항산화스트 레스가 일어나면 항산화작용에 관여하는 효소인 GST효소가 활성화 되는데 Kim(2006)은 TiO₂나노입자의 응집현상이 SOD (항산화효소)의 증가에는 관여하지 않지만 GPx, GST 항산화 효소가 TiO₂ 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하였다고 보 고하였다. 이는 TiO₂가 물벼룩에 대해 산화적 스트레스를 유 도한다는 증거가 되므로 본 연구에서도 산화적스트레스로 인한 유영저해인 것으로 생각된다. 따라서 차후 연구를 통 해 산화적스트레스 반응이 나노입자 자체의 문제인지, 중금 속 이온의 영향인지 또는 나노입자와 용해이온 모두의 영향 인지 연구 할 가치가 있다고 여겨진다. 또한 용해 이온의 생 물 체내·외의 영향 또한 구분하여 세분화 할 수 있을 것으로 본다.

종합적으로 두 나노입자 모두 시간 및 농도가 높아질수록 D.magna가 유영하는데 영향을 미친 것으로 나타났으며, 특 히 ZnO나노입자가 TiO₂나노입자에 비해 더 큰 영향을 미치 는 것으로 나타났다.

3.3.폐사율(Death Rate)

M4배지에 두 나노입자를 첨가한 후 D.magna의 폐사율을 살펴보았다(Fig. 5). 우선 대조구(0 mg/L)에서는 전 실험 관찰 기간 폐사한 개체는 보이지 않았다. ZnO나노입자의 경우 24 시간 경과 후 10 ppm에서 30 %, 50 ppm에서 60 %, 100 ppm에 서 70 %로 D.magna가 폐사된 것으로 관찰 되었으며, 48시간 경과 후에는 10 ppm 이상 전 농도 모두 폐사된 것으로 나타 났다. 72시간에서는 48시간 이전의 결과와 달리 0.1 ppm에서 전 개체중 50 %가 폐사되었으며, 0.1 ppm 이상의 농도에서는 48시간의 결과와 같이 모두 D.magna가 폐사된 것으로 나타 났다(Fig. 5A).

TiO₂나노입자 경우 ZnO나노입자와 달리 48시간이 경과되 더라도 폐사된 개체는 보이지 않았다. 하지만 72시간 경과된 시점에서 10 ppm과 50 ppm에서 10 % 이하, 100 ppm에서는 20 % 정도 D.magna가 폐사된 것으로 관찰되었다(Fig. 5B).

ZnO나노입자에서는 시간 및 농도가 높아질수록 폐사되는 비율이 높았으며, TiO₂나노입자에서는 72시간이 경과된 시점 의 10 ppm 이상의 농도에서 폐사하는 것으로 관찰되었다.

4.결 론

ZnO, TiO₂나노입자가 수생태계에 노출되어 생물종인 D.magna에 어떠한 영향을 미치는지 유영저해와 폐사율을 통 해 살펴보았다. ZnO나노입자는 분말 상태에서 10~20 nm이었 으나 M4배지에 첨가하였을 경우 약 70배 정도 증가하였으 며, TiO₂나노입자는 분말상태에서 40 nm였지만, M4배지에 첨 가하였을 경우 약40배 정도 증가한 것으로 나타났다. 고체상 입자가 극성 용액이나 전해질을 가진 용액 중에 존재하면 입자 표면이 하전을 띄게 되고, 표면전위와 반대부호인 용 액안의 이온(일반적으로 쌍이온이라함)이 정전기적으로 표 면에 끌려 응집 하게 된다(Lee and Suh, 2008). 따라서 이 연 구에서는 나노입자가 고유의 물리적 특성인 작은 크기에서 비롯한 높은 표면에너지에 따라 용액 속에서 정전기적으로 응집이 된 것이라 생각된다. 이와 같은 결과는 앞으로 더 많 은 연구를 통해 밝혀내야겠지만 나노물질이 수계에서 그 크 기를 유지하며 분산이 되는 것이 현실적으로 어렵다는 것을 제시하고 있다.

두 나노입자를 M4배지에 첨가한 후 D.magna의 유영저해 와 폐사율을 살펴보았는데, 유영저해의 경우 ZnO와 TiO₂나 노입자는 시간 및 농도가 증가할수록 D.magna의 유영에 큰 영향을 주는 것으로 보였다. 특히 ZnO나노입자의 경우 48시 간이 경과되는 시점부터 10 ppm 이상 전 개체가 유영저해를 보였다. 폐사율의 경우 유영저해와 마찬가지로 시간 및 농 도가 높아질수록 폐사되는 비율이 높아졌으며, TiO₂나노입 자에 비해 ZnO나노입자에서 폐사되는 비율이 높았다. 이러 한 결과는 같은 농도라도 TiO₂나노입자보다 ZnO나노입자가 영향이 큰 것으로 나타났다. Kim(2014)은 CuO나노입자의 용 존 이온 농도가 반수영향농도(EC₅₀) 값(44 μg L-1 for 72 h)보 다 매우 낮은 실험에서도 급성독성의 증가를 보였는데 이는 용존 이온이 아닌 나노입자의 영향으로 판단된다고 보고하 였는데 본 연구의 ZnO의 이온독성에 고려한 영향과 달리 독 성 메카니즘은 입자별로 다른 것으로 생각된다.

Kennedy et al.(2012)은 CuO나노입자의 경우, 노출시간이 증 가할수록 응집이 계속적으로 증가하였으며, 응집되는 정도 가 나노입자의 농도가 높을수록 급격히 일어나는 것을 확인 할 수 있었고 이것은 나노입자의 농도가 높을수록 나노입자 끼리 상호작용하는 빈도수가 높아져서 응집이 더 빨리 일어 났기 때문이라고 판단하였다. 이는 나노입자의 응집크기가 용액성분에 따른 크기변화만이 아니라 노출 정도에 따라 그 크기가 상이하게 달라지며 그에 따른 영향도 달라질 수 있 다는 것으로 볼 수 있다. 이에 농도에 따른 시간별 응집 크 기의 변화를 알아보고 더불어 생물영향도 연구해 볼 가치가 있다고 생각된다.

본 연구에 사용한 Daphnia magna는 95 %가 담수종인 시험 생물로 해양환경에 관한 직접적인 영향을 제시 할 수는 없 다. 하지만 나노입자의 특성상 용액 속에 존재하면 용액성분 에 따라 응집 크기가 달라지는 것을 확인 할 수 있는데 이러 한 특징은 수생태계의 여러 환경(담수와 기수, 해수 등)에 미 치는 영향이 제각기 다를 것으로 예상된다. 따라서 기수해역 과 해수에서의 영향을 국제기구의 대표적인 독성평가 시험 종을 이용하여 해양생태계의 영향에 관한 나노입자 실험의 방향을 제시 할 수 있는 논문이라 생각된다. 현재까지의 연 구는 단순히 생물독성에 관한 영향을 알아보았다면 앞으로 는 이러한 영향의 독성 메카니즘과 먹이연쇄에 따른 나노입 자의 생물농축에 관한 영향을 연구해 볼 수 있을 것이다.